角膜共焦显微镜在真菌性角膜炎诊疗中的应用价值探讨

姜丽丽 王 勇 史春生 詹 邶 李 晶

真菌性角膜炎早期诊断困难，缺乏有效的治疗措施，且大部分患者预后不良，是严重的致盲眼病之一。研究[1-2]发现，真菌性角膜炎发病率有逐年上升趋势。目前临床上应用的抗真菌药物主要包括多烯类、唑类、烯丙胺类、还有氟胞嘧啶类等药物。Garg等[3]认为，在长期使用抗真菌药物治疗的患者中，有9.0%～26.3%的患者角膜形态学发生改变，这可能与药物的眼部毒性作用有关。因此，尽早确诊、及时使用抗真菌药物治疗及准确把握停药时机对真菌性角膜炎患者至关重要[4]。共焦显微镜能够对活体组织进行无创性检查，并已广泛应用于眼科。本研究收集真菌性角膜炎患者21例，通过对实验室、角膜共焦显微镜检查结果及患者复诊时共焦显微镜检查的菌丝残留情况进行研究，评估共焦显微镜在真菌性角膜炎诊疗中的应用价值，以期对临床工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2017年1月安徽省第二人民医院诊治的真菌性角膜炎典型表现患者21例(21眼)，所有患者均行角膜共焦显微镜检查和实验室真菌涂片检查，其中男性13例(13眼)，女性8例(8眼)，年龄36～80岁，平均(62.50±16.27)岁。以上患者行裂隙灯检查可见以下体征中至少1项：白色致密的角膜浸润病灶，并可合并免疫环、伪足、卫星灶、角膜后沉着物、前房积脓等；裂隙灯检查排除合并细菌性角膜炎或病毒性角膜炎患者以及其他角膜变性和营养不良等疾病。所有患者均未使用过抗感染或抗真菌药物。诊疗过程中患者均积极配合治疗，无一例随访缺失。

1.2 方法

1.2.1 角膜共焦显微镜检查方法 在进行角膜刮片以前，每例患者先行角膜共焦显微镜检查。采用以卤素灯为光源的角膜共焦显微镜，放大1 000倍，分辨率1 μm，物镜与角膜的安全距离为1.98 mm，以卡波姆凝胶为介质。采用自动模式，对角膜全层两次扫描，扫描间隔1.50 μm，共获得350幅图像。在病灶中央，病灶边缘内侧1 mm处3点、6点、9点、12点处分别检查5次，检查阴性的患者再次检查，3次结果均阴性视为检查结果阴性。筛选需要的图像存盘[5]。

1.2.2 角膜刮片实验室检查方法 0.05%盐酸丙美卡因滴眼液(Alcon，16K17CA)表面麻醉后，5 mL注射器针头先拭去溃疡面附着坏死组织及脓性分泌物，刮取溃疡边缘组织于载玻片，即刻送实验室行染色镜检。镜检阴性的患者再次刮片检查，3次镜检结果均阴性视为实验室检查阴性。

1.2.3 治疗方法 所有患者均使用5%那他霉素眼用混悬液(Alcon，H20080104)局部点眼，溃疡灶大于5 mm，伴有严重的前房反应或者积脓者，加用抗真菌药物口服或静滴，辅以扩瞳、营养角膜、消炎、补充大剂量维生素等治疗。抗真菌治疗有效的患者在随诊过程中行角膜共焦显微镜检查，以临床症状体征阴性与共焦显微镜检查无菌丝残留作为停药标准。患者分别在治疗后1周、2周、1个月、3个月及6个月，采用门诊复查的方式进行随访。

1.3 疗效评估标准 治愈：疼痛症状消失，角膜溃疡愈合，荧光素染色阴性，前房积脓消失；好转：疼痛症状明显减轻，角膜溃疡部分愈合，前房积脓减少或者消失，荧光素钠染色(±)；无效：疼痛症状无改善，角膜溃疡扩大或穿孔，前房积脓加重，结膜囊分泌物涂片镜检有真菌菌丝[6]。

2 结果

2.1 角膜共聚焦显微镜及角膜刮片实验室检查结果 实验室与角膜共焦显微镜检查均为阳性者11例(52.38%)，实验室检查阴性而共焦显微镜检查阳性者7例(33.33%)，共焦显微镜检查阴性而实验室检查阳性1例(4.76%)。共焦显微镜检出率为85.71%，实验室检出率为57.14%，2种方法检出率的差异有统计学意义(P=0.043)。检查情况见图1、2。

图1 镜检可见细长分枝状结构菌丝，呈深紫红着色(黑箭头)(革兰染色×400)

图2 角膜共焦显微镜检查，菌丝直径为3～6 μm

注：A为在深层角膜基质中可见粗大的神经纤维走形笔直，较上皮下神经纤维粗大(黑箭头)，而真菌菌丝呈现细、短的扭曲走形(白箭头)，旁边可见高反光树突状及炎性细胞；B为在浅层角膜基质中可见真菌菌丝呈高反光扭曲环状(白箭头)，周围环绕大量的炎症细胞(黑箭头)，伴有高反光的坏死组织；C为在角膜基质中可见大量分支状高反光菌丝(白箭头)，周围是高反光激活态基质层细胞；D为在角膜基质中可见大量竹节状菌丝，粗细不均，排列杂乱(白箭头)，伴有大量炎症细胞浸润(黑箭头)

2.2 治疗结果 21例患者中，8例(38.10%)患者药物治疗效果不佳，5例(23.81%)接受结膜瓣遮盖，术后继续使用抗真菌药物治疗，2例(9.52%)转外院行角膜移植手术，1例(4.76%)患者因感染不能控制发展为全眼球炎行眼球摘除术。治疗好转13例(61.90%)，均留有角膜瘢痕，在治疗后1周、2周、1个月、3个月及6个月随访过程中，同时满足症状体征阴性者与角膜共焦显微镜检查无菌丝残留为停药标准，半年跟踪随访时间内均未见感染复发。有4例(19.05%)患者在症状体征阴性时，角膜共焦显微镜检查仍可见基质层菌丝残留，继续使用药物治疗至角膜共焦显微镜检查转阴性。

3 讨论

活体角膜共焦显微镜因具备无创、可靠、快速诊断的优点，在真菌性角膜炎的诊断和治疗中具有独特的优势。在角膜共焦显微镜的帮助下，真菌性角膜炎患者可以实现早发现、早诊断、早治疗，从而避免严重并发症的出现。卤素灯和激光角膜共焦显微镜在角膜疾病的诊断中各具优势，激光共焦显微镜光源穿透性更佳，适用于对炎症水肿组织的观察，因此被推荐作为角膜炎症诊断的首选。本研究使用卤素灯共焦显微镜来观察疑是真菌感染的活体角膜组织，因为卤素灯共聚焦显微镜可以从上皮到内皮反复扫描，间隔1.50 μm可以获得1幅图片，1次扫描可以获得350张图片，如果发现真菌菌丝，再结合实验室检查，即可做出快速诊断。而激光共焦显微镜1次扫描仅能探测60 μm的深度，且探头和患者角膜相接触，加重真菌性角膜炎的患眼疼痛感，无法取得部分患者的配合，影响检查结果；同时共聚焦显微镜也已成功应用在阿米巴性角膜炎的早期诊断和治疗中[7]。据国外报道[8]，1/3的角膜溃疡实验室检查是阴性的，因此共聚焦显微镜在角膜疾病中的运用有助于早期快速鉴别诊断角膜溃疡。

本研究中，共焦显微镜的检出率为85.71%，而实验室检查检出率仅为57.14%。共焦显微镜的检出率高于实验室检出率，其检出率接近西方国家的报道的80%～94%[9-11]。在治疗好转后症状体征均为阴性的随诊患者中，仍有4例患者行共焦显微镜检查检出真菌菌丝，表明根据临床症状和体征来制定停药时机是不可靠的，停药后该类患者仍有可能会复发。停药时机应该在临床症状体征、实验室检查结果及角膜共焦显微镜检查结果相结合的情况下做出判断。对于经过治疗已形成角膜瘢痕的患者，尤其应该注意对瘢痕周边纤维化甚至透明的角膜组织进行共焦显微镜扫描。

本研究同时运用共焦显微镜Z扫描模式对真菌菌丝在角膜组织中的深度进行定位，发现部分患者的内皮上仍然发现菌丝，这可能是部分真菌角膜炎患者即使进行板层角膜移植后仍然复发的原因，这部分患者可能需要行穿透性角膜移植治疗。在未来的临床工作中，笔者将对共焦显微镜Z扫描模式在真菌性角膜炎的治疗中的运用进行深入探索。