助孕丸的质量标准研究

廖 娴，周楚娟，梁芷韵，黄月纯

(1.广州中医药大学第一附属医院，广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广州 510006)

助孕丸是广州中医药大学第一附属医院的医院制剂，原方是由女贞子、黄芪、白术、党参和续断等8味中药组成的复方制剂。有健脾固肾之功效，主治脾肾两虚之胎漏胎动不安等症，临床应用效果较好，受到广大患者欢迎。方中黄芪具有补气升阳、固表止汗等功效[1]，主要含有多糖、黄酮类、皂苷类及氨基酸等化学成分[2-4]。女贞子来源于木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit．的干燥成熟果实，有滋补肝肾、明目乌发的功效[1]。现代药学研究发现，女贞子含有多种类型的化合物，其中主要的有效成分有齐墩果酸、特女贞苷和红景天苷等，具有抗肿瘤、调节免疫功能、护肝和降血脂等生物活性[5-6]。特女贞苷为化合物中的环烯醚萜类[7-8]。《中国药典》2015年版一部关于女贞子的含量测定以特女贞苷为指标。目前，助孕丸的检测标准为性状及相关丸剂项下检查，缺乏相关的定性和定量指标。为有效控制助孕丸的质量，作者对方中以粉末入药的党参、白术和续断进行了显微鉴别，对主要药味黄芪和女贞子分别进行了TLC定性和液相定量研究，初步建立了专属性强、稳定可靠的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(包括DAD检测器和 Agilent 1200色谱工作站)，美国 Agilent 公司；Olympus CX41显微摄像仪(日本奥林巴斯公司)；CAMAG Linomat-5半自动点样仪，CAMAG ADC2全自动展开仪(瑞士卡玛公司)；硅胶G预制板(青岛海洋化工厂)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；XA105型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 黄芪对照药材(批号120974-200508)、特女贞苷对照品(批号111926-201401)，均由中国食品药品检定研究院提供。助孕丸(批号:160601,161001,161101，制剂中心自制)；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1显微鉴别 取本品，研细，置于显微镜下观察：联结乳管直径12～15 μm，含细小颗粒物(党参)[9-10]。草酸钙针晶细小，长10～32 μm，不规则地填塞于薄壁细胞中(白术)[11]。草酸钙簇晶直径至45 μm，存在于淡黄棕色皱缩的薄壁细胞中，常数个排列成行(续断)[12]。结果见图1。

图1显微鉴别结果

A.联结乳管(党参)；B.草酸钙簇晶(续断)；C.草酸钙针晶(白术)。

Fig.1 Results of microscopic identification

A.connecting tube (Radixcodonopsis)；B.calcium oxalate cluster crystal (Radixdipsaci)；C.calcium acicular crystal (RhizomaAtractylodismacrocephala).

2.2TLC鉴别 取助孕丸5 g，研细，加50 mL乙醇加热回流20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加质量浓度为3 g·L-1的氢氧化钠溶液15 mL使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5～6，用乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有无水硫酸钠适量的滤纸滤过，蒸干滤液，残渣加1 mL乙酸乙酯溶解，即得。取处方中缺黄芪的阴性对照样品5 g，按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。另取2 g黄芪对照药材，用上述方法制成对照药材溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验[1]，吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点在同一硅胶G薄层板上，用三氯甲烷-甲醇(10∶1)作为展开剂，展开，取出，晾干，置于氨蒸气中熏后，在紫外光灯365 nm处检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色荧光主斑点，阴性样品无干扰。见图2。

图2黄芪TLC图

1.黄芪对照药材；2～4.供试品(批号161101)；5.黄芪阴性对照。

Fig.2 TLC chromatogram of RadixAstragali

1.RadixAstragalireference substance；2-4.samples (batch number 161101)；5.negative control.

2.3含量测定

2.3.1色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(30∶70)[13]；检测波长：224 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3.2对照品溶液的制备 取特女贞苷对照品13.20 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.320 g·L-1的对照品储备液，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得特女贞苷对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取助孕丸粉末2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL稀乙醇溶液，称定质量，超声处理20 min，冷却至室温，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4专属性实验 取女贞子阴性对照样品2.0 g，精密称定，按照2.3.3项下方法，制得女贞子阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按照2.3.1项下色谱条件测定，结果阴性对照在特女贞苷峰相同保留时间位置上未见色谱峰，说明阴性样品对特女贞苷含量测定无干扰，见图3。

图3助孕丸HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.特女贞苷。

Fig.3 HPLC chromatograms of Zhuyun Pills

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.specnuezhenide.

2.3.5线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为1.320 g·L-1的特女贞苷对照品储备液0.2，0.5，1.0，1.5和2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，分别加甲醇定容至刻度，分别精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，测定峰面积。按照2.3.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积。以进样量为横坐标(x)、色谱峰面积为纵坐标(y)进行线性回归。特女贞苷的回归方程及相关系数为：y=1 157.3x-20.591(r=0.999 8)。结果表明，特女贞苷在0.264 0～2.640 μg范围内线性关系良好。

2.3.6精密度实验 精密吸取特女贞苷对照品溶液10 μL，按照2.3.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积RSD值为0.38%，结果表明，仪器精密度良好。

2.3.7重复性实验 取样品(批号160601)6份，分别按照2.3.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，结果特女贞苷的平均含量为1.668 mg·g-1，RSD值为1.12%。结果表明，该实验重复性良好。

2.3.8稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，12和24 h后进样分析，测定峰面积，结果特女贞苷峰面积的RSD值为1.01%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9回收率实验 精密称取已知含量的样品(批号160601)6份，每份1.0 g，分别加入质量浓度为321.2 μg·mL-1的特女贞苷对照品溶液各5 mL，按照2.3.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算加样回收率，结果见表1。

表1特女贞苷加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test of specnuezhenide(n=6)

取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.0021.6711.6063.24197.76 98.11.561.0041.6751.6063.25198.13 1.0051.6761.6063.21595.83 1.0111.6861.6063.25697.76 1.0051.6761.6063.25998.57 1.0131.6901.6063.305100.56

2.3.10样品测定 分别取各批号样品2 g，每批平行操作2次，共6份，精密称定。分别按照2.3.3和2.3.2项下方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10 μL，注入液相色谱仪，按照2.3.1项下色谱条件测定，结果3批样品中特女贞苷的平均含量分别为1.668，1.673和1.677 mg·g-1。

3 讨论

3.1显微鉴别 本制剂中党参、白术和续断为直接粉碎后粉末入药，因此显微鉴别的专属性和稳定性对制剂的鉴别具有重要意义[14]。在显微鉴别研究中，党参的联结乳管、白术的草酸钙针晶和续断的草酸钙簇晶均是具有代表性的显微结构，专属性强、显微特征清晰、稳定性高，故列入标准。

3.2TLC鉴别 在TLC鉴别实验中，参考药典及文献方法进行TLC鉴别研究[15-16]，以黄芪甲苷为对照品，但黄芪甲苷斑点不清晰，且阴性有干扰。后参考以黄芪对照药材为对照的TLC方法[1]，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂，展开，置于氨蒸气中熏后，置于紫外光灯365 nm处检视。实验结果显示，供试品色谱中斑点清晰，阴性对照无干扰。考察了不同点样量(5和10 μL)、不同薄层板(青岛海洋化工厂硅胶G板和烟台市化学工业研究所硅胶G板)、不同温度(6，25和30 ℃)及不同湿度(33%，55%和75%)对黄芪TLC鉴别的影响，结果表明，点样量为10 μL，点于青岛海洋化工厂硅胶G板时效果较好，而温度和湿度对黄芪TLC色谱展开的影响相对较小。通过对不同批次的供试品进行分析，表明本实验建立的黄芪TLC鉴别方法斑点清晰、专属性强、耐用性好，可用于该制剂的质量控制。

3.3含量测定 在女贞子的含量测定研究中，大多数以齐墩果酸为指标[17-19]，而特女贞苷对测量女贞子更具有专属性[13]。在供试品溶液的制备中，比较了甲醇、稀乙醇和体积分数为75%的乙醇等不同溶媒提取方法，结果稀乙醇的提取效率较高，因此确定了稀乙醇为提取溶剂。同时，对加热回流1 h和超声处理20和30 min的不同提取方法进行了比较分析，结果所测含量无明显差异，故选用较简单的超声处理20 min作为提取方法。参考药典及文献[13，20]，女贞子项下含量测定方法选用流动相为甲醇-水，分离效果较好，能达到分离要求。