复方苦参洗剂对家兔皮肤和阴道黏膜刺激性及对豚鼠皮肤致敏性实验研究

沈 迪，张信岳，李 钦，石晨阳

(1.浙江中法制药有限公司，嘉兴 314008；2.浙江省医学科学药物研究所，杭州 310013)

复方苦参洗剂是浙江中法制药有限公司生产的妇科洗液，由苦参、黄柏和蛇床子等15味中药组成[1]，该药物已上市用于临床多年，有清热解毒、燥湿止痒的功效[2]，用于改善妇女带下过多、外阴瘙痒等症状。根据中成药现代化以及中药安全性再评价的要求并参考《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014年版)[3]，本文就复方苦参洗剂对家兔完整或破损皮肤以及阴道黏膜的局部刺激反应和对豚鼠的皮肤致敏性反应进行研究，为临床安全用药提供依据[4]。

1 仪器与材料

1.1仪器 MOTIC生物显微图像采集分析系统，厦门麦奥迪克仪器公司。

1.2试药 复方苦参洗剂(批号20150712)，蛇床子素含量为28 μg·mL-1，包装规格：280 mL·瓶-1，浙江中法制药有限公司；质量浓度为9 g·L-1的氯化钠注射液(批号B15050201，规格2.25 g∶250 mL，浙江国镜药业有限公司)；2.4-二硝基氯苯(批号960801，上海试剂一厂)，临用前用丙酮溶解并稀释成10 g·L-1作为致敏质量浓度，1 g·L-1作为激发质量浓度。

1.3动物 家兔，新西兰种，12只，2～4个月龄，体质量1.8～2.0 kg，购自杭州余杭科联兔业专业合作社，实验动物质量许可证号: SCXK(浙)2013-0055；实验动物质量合格证号：1706190009。用浙江省实验动物中心生产的全价颗粒饲料喂养，自由饮水。

豚鼠，DHA系，40只，雌雄各半，2～3个月龄，体质量250～300 g，购自无锡市惠山江南实验动物场，实验动物质量许可证号:SCXK(苏)2015-0004；实验动物质量合格证编号：201711316。

2 方法

2.1家兔完整或破损皮肤刺激性实验 健康新西兰家兔4只，雌雄各半。每只家兔背部沿脊柱两侧脱毛共4块皮肤(每块大小5 cm×5 cm)；24 h后，将每只家兔前部2块脱毛皮肤消毒后用针头划破(呈#字形)，至渗血为度，作为破损皮肤；后部2块作为完整皮肤。4只家兔左侧皮肤涂抹复方苦参洗剂样品，右侧皮肤涂抹生理盐水。复方苦参洗剂临用前用蒸馏水稀释成500 mL·L-1的溶液，每日在相应皮肤上涂抹给药1次，以纱布贴敷包裹4 h后温水洗去药物，连续7 d，给药体积均为0.5 mL；末次给药贴敷4 h后温水洗去药物，进行观察和评价[3，5-9]。

2.2家兔阴道黏膜刺激性实验 取健康雌性新西兰家兔8只，体质量1.8～2.0 kg，随机分为阴性对照组和复方苦参洗剂样品组，每组4只。复方苦参洗剂临用前用蒸馏水稀释成500 mL·L-1的溶液。分别用导尿管在家兔阴道(距阴道口4～5 cm)中灌入2 mL生理盐水(阴性对照组)及2 mL的复方苦参洗剂，每日给药1次，连续7 d，每次给药前观察家兔局部及全身反应，末次给药24 h后处死家兔，观察切片并评价[3，10-11]。

2.3豚鼠皮肤致敏性实验 健康DHA系豚鼠40只，雌雄各半，体质量250～300 g，背部脊柱两侧各脱毛3 cm×3 cm，24 h后，随机分为复方苦参洗剂组、阴性对照组(生理盐水)以及阳性对照组(2，4-二硝基氯苯)，其中复方苦参洗剂组20只，阴性及阳性对照组各10只，均雌雄各半。复方苦参洗剂临用前用蒸馏水稀释成500 mL·L-1的溶液，分别在左侧脱毛区涂抹相应药物，阴性对照组涂抹生理盐水，阳性对照组涂抹质量浓度为10 g·L-1的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液，给药体积均为0.2 mL·只-1，给药后6 h用温水洗去受试物；第7和14天同样方法重复致敏给药各1次；末次给药后14 d，分别在右侧脱毛区涂抹相应药物进行激发，阴性对照组用生理盐水，阳性对照组用质量浓度为1 g·L-1的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液，给药体积均为0.2 mL·只-1；激发给药6 h后温水洗去受试物，立即观察并按要求进行评价[3，6-9]。

2.4观察和评价指标

2.4.1家兔完整或破损皮肤刺激性实验 观察去除受试物后1，24，48和72 h涂覆部位有无红斑和水肿等情况，并用数码相机拍摄照片。按照皮肤刺激反应评分标准以及皮肤刺激强度评价标准进行刺激反应评分，并评价受试药物对皮肤的刺激强度。皮肤刺激反应以红斑和水肿评分：以红斑和水肿评分相加为总积分，总积分最高为8分。红斑：无红斑为0分；轻度红斑(勉强可见)为1分；中度红斑(明显可见)为2分；严重红斑为3分；紫红色红斑到轻度焦痂形成为4分。水肿：无水肿为0分；轻度水肿(勉强可见)为1分；中度水肿(明显隆起)为2分；重度水肿(皮肤隆起1 mm，轮廓清楚)为3分；严重水肿(皮肤隆起1 mm以上并有扩大)为4分。皮肤刺激强度评价标准根据总积分的数值进行判断：0～0.49为无刺激；0.5～2.99为轻度刺激性；3.0～5.99为中度刺激性；6.0～8.0为重度刺激性[3，12-13]。

2.4.2家兔阴道黏膜刺激性实验 取出家兔阴道，肉眼观察记录有无充血、红肿和溃疡等情况，进行肉眼检查刺激分级评分，记录刺激反应现象：无改变或无明显改变为0分；轻度充血、有少量分泌物为1分；中度充血、分泌物较多为2分；重度淤血、水肿、分泌物很多、黏膜变性为3分。刺激性分级标准：平均分值为0～0.4为无刺激性；0.41～1.5为轻度刺激性；1.51～2.5为中度刺激性；>2.5为重度刺激性。肉眼观察和评分完毕后，将阴道组织放入40 mL·L-1甲醛溶液中固定24 h以上，选取阴道的两端和中央3个部位制片，HE染色，进行组织病理学检查，进行刺激反应镜下观察和分级评分，阴道黏膜刺激反应(镜下检查)评分标准。A．上皮组织：正常，完好无损为0分；细胞变性或变扁平为1分；组织变形为2分；局部糜烂为3分；广泛糜烂为4分。B.白细胞浸润(每个高倍视野)：无为0分；极少(<25个)为1分；轻度(26～50个)为2分；中度(51～100个)为3分；重度(>100个)为4分。C．血管充血：无为0分；极少为1分；轻度为2分；中度为3分；重度伴血管破裂为4分。D．水肿：无为0分；极少为1分；轻度为2分；中度为3分；重度为4分。刺激反应积分=A+B+C+D。阴道黏膜刺激强度分级按照刺激反应积分的分值来评价：<1为无刺激；1～<5为极轻刺激；5～<9为轻度刺激；9～<12为中度刺激；≥12为重度刺激。采用MOTIC生物显微图像采集分析系统摄片[3，14-16]。

2.4.3豚鼠皮肤致敏性实验 对阴性对照组、阳性对照组和样品给药组的涂抹情况进行观察，并于24和48 h再次观察皮肤过敏反应情况，同时以数码相机拍摄照片。按照皮肤过敏反应评分标准进行过敏反应症状评分(以红斑和水肿评分)。红斑：无红斑为0分；轻度红斑为1分；中度红斑为2分；重度红斑为3分；水肿型红斑为4分。水肿：无水肿为0分，轻度水肿为1分；中度水肿为2分；重度水肿为3分。过敏反应发生率(%)=每组过敏动物数÷每组动物总数×100%[3，17-18]。

3 结果

3.1家兔完整或破损皮肤刺激性实验 复方苦参洗剂在家兔完整或破损皮肤上连续涂抹用药7 d，给药期间所有家兔均未见异常全身反应；去除受试物后1，24，48和72 h涂抹部位均未见红斑、水肿等现象，与生理盐水对照侧皮肤比较无明显差异，按照上述标准评分均为0分，表明复方苦参洗剂样品多次给药对家兔完整或破损皮肤均不产生刺激性反应。

3.2家兔阴道黏膜刺激性实验 每日给药时观察，阴性对照组和复方苦参洗剂组外阴部和阴道口均无异常分泌物，也无充血和水肿现象，末次给药24 h后解剖家兔阴道，复方苦参洗剂组以及阴性对照组家兔阴道均未见有溃疡、坏死等异常病变；病理组织学检查显示，复方苦参洗剂样品组以及阴性对照组各家兔阴道组织结构清晰、黏膜完整，黏膜下结缔组织和肌层偶见不同程度充血、水肿或炎性细胞浸润等异常病变，组间未见明显差异。见图1。

图1复方苦参洗剂对家兔阴道黏膜刺激实验病理学HE染色光镜照片(×10)

A.复方苦参洗剂阴道组织结构清晰、黏膜完整。可见极少白细胞浸润、极少血管充血及极少水肿；B.阴性组(生理盐水)阴道组织结构清晰、黏膜完整。可见极少白细胞浸润、极少血管充血及极少水肿；①阴道组织结构清晰，黏膜完整；②极少白细胞浸润、极少血管充血及极少水肿。

Fig.1 Microscopic photos of HE staining applied in pathology on experimental study of Fufang Kushen Lotion (×10)

A.Using Fufang Kushen Lotion，the structure of the vagina was clear and the mucous membrane was complete.Few white blood cells infiltration，minimal blood vessel congestion and minimal edema were seen；B.Using normal saline as negative control group，the structure of the vagina was clear and the mucous membrane was complete.Few white blood cells infiltration，minimal blood vessel congestion and minimal edema were seen；①the structure of the vagina was clear and the mucous membrane was complete；②few white blood cells infiltration，minimal blood vessel congestion and minimal edema.

表1复方苦参洗剂对阴道黏膜刺激强度分级(病理观察)

Tab.1 Classification of vaginal mucosa irritation intensity on Fufang Kushen Lotion (pathological observation)

组别兔号反应积分x±s反应强度生理盐水阴性对照133.5±0.58极轻233443复方苦参洗剂143.3±0.50极轻243243

3.3豚鼠皮肤致敏性实验 阳性对照组在给予2，4-二硝基氯苯激发给药后6，24和48 h给药部位皮肤均出现不同程度的红斑，过敏反应发生率为100%，过敏反应平均值在激发后6 h最高，48 h后基本恢复。

复方苦参洗剂组豚鼠在激发给药后6，24和48 h给药部位皮肤均未见红斑或水肿等现象，与生理盐水对照组比较无明显差异，按照上述标准评分均为0分，结果表明，在本实验条件下，复方苦参洗剂对豚鼠皮肤不产生过敏反应。见表2。

表2复方苦参洗剂皮肤过敏反应分值

组别激发给药后不同时间分值6 h24 h48 h阴性对照组(生理盐水)0±00±00±0阳性对照组(2,4-二硝 基氯苯)1.9±0.3*0.9±0.3*0.2±0.4*复方苦参洗剂0±0#0±0#0±0#

注：阴性对照组及阳性对照组，n=10；复方苦参洗剂，n=20。与阴性对照组比较*P<0.001；与阳性对照组比较#P<0.001。

4 讨论

随着《中华人民共和国中医药法》的颁布实施，继承和弘扬中医药，保障和促进中医药事业发展，是从事中医药行业的神圣使命[19]。中草药洗剂类产品在妇科的应用中具有广泛前景。中草药洗剂大多是复方制剂，一般由5种以上中药配伍而成，其处方的化学成分分析难度大，发挥作用的有效成分难以界定，有毒的化学成分也不明确[20]。此外，中药饮片的质量因气候条件、生长环境以及野生家种等都会有一定程度的波动。为了进一步加强复方制剂的质量控制并保证临床用药的安全性，针对中药材配伍复杂、毒性成分不明确的中药复方制剂，依据《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014年版)，对中成药按照要求进行临床前安全性评价以及临床上市后的安全性再评价有积极和重要的意义。

复方苦参洗剂自上市以来，临床应用广泛，与栓剂等剂型相比，其优点是使用方便、起效均匀迅速，其pH值控制在6.0～7.0，适宜的酸碱度可改善局部微环境，有效控制感染。该药品至今有1 000多万人次使用，不良反应发生率低，其用法是用温开水稀释药液体积分数至30%～50%，用于清洗外阴。该药品对局部治疗有作用，在对该药品进行安全性再评价时，依据现有说明书的稀释浓度给药，考虑到在清洗外阴时会接触到阴道黏膜以及周围皮肤，由于未见到有关该药品的阴道黏膜的刺激性实验研究文献，参照Eckstein刺激性评价标准和《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014年版)的黏膜刺激评价标准，增加家兔阴道黏膜的刺激性实验，以此验证该药品的安全性。通过本实验确认了在说明书的指导剂量下，复方苦参洗剂对家兔阴道黏膜无刺激。

本实验通过复方苦参洗剂对家兔完整或破损皮肤以及阴道黏膜的局部刺激反应和对豚鼠的皮肤致敏性反应的研究，结合肉眼观察和病理组织学检查结果，证明该药对机体局部皮肤和黏膜使用是安全的。