超高压处理和二氧化氯处理对改善鱼糕品质的机制研究

杜杰，沈韫韬，马良，郭婷，余永，张宇昊（西南大学食品科学学院，重庆400715）

我国是世界上水产品产量最大的国家[1]，近年来我国水产品加工业发展迅速，2016年用于加工的水产品达到2 165.44万吨，占我国水产品总量的31.3%[2]。近年来，海洋资源锐减，淡水鱼产量呈现较快增长，加工利用淡水鱼成为了我国水产品的加工方向[3]。但我国淡水鱼加工相对落后，目前加工总量不足淡水鱼总量的15%，严重制约了淡水鱼业的发展[4]。

鱼糜是指鱼肉经过采肉、漂洗、精滤等工序制得的湿的肌原纤维蛋白浓缩物，属于完全蛋白[5]。鱼糜制品是指向鱼糜中加入2%～3%的食盐，经过25 min的空擂、盐擂和调味擂，成型加热后制得的富有弹性的水产品[6]。鱼糜制品加工便利，富有多种能被人体吸收利用的优质蛋白，能满足人们对低脂肪、低胆固醇的要求，是一种发展前景很好的水产食品[7]。鱼糜制品是生产和消费量最大的水产品之一，也是我国最大宗的水产加工制品之一，在全球范围内具有很大的市场潜力和发展前景，2000年至2008年我国鱼糜制品年产量以28.86%的复合增长率递增[8]。实现淡水鱼产业发展的途径之一就是把低值淡水鱼转化、加工成易运输、食用方便的鱼糜制品。

湖北荆州地区素有制作食用鱼糕的传统，是我国淡水鱼糜制品的主要加工地之一。目前该地区已有企业通过简单的真空包装鱼糕面向市场销售，但保质期一直制约着该产品实现规模生产。一些企业尝试通过高温杀菌处理延长产品的保质期，但高温杀菌会造成产品的口感及产品的颜色出现明显劣变。

本研究基于现存的问题，在鱼糕传统生产工艺中增加减菌程序，分别采用超高压和二氧化氯（ClO2）处理对鱼糕进行减菌，探究二者对延长鱼糕保质期的效果，评价处理手段对鱼糕在贮藏期内的品质影响，并对其影响鱼糕品质变化的机理进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

鲢鱼：重庆市北碚区雄风超市。

二氧化氯（食品级）：山东华实药业；氧化镁、硼酸、三氯乙酸、盐酸、冰乙酸（分析纯）：成都市科龙化学试剂厂；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris，优级纯）：BIO BASIC公司；质量分数为30%丙烯酰胺（优级纯）：北京索莱宝科技有限公司；甘氨酸（Glycine，分析纯）：生工生物工程（上海）有限公司；考马斯亮蓝R-250（优级纯）：BIO BASIC公司；标准蛋白（分子量 10 kDa～200 kDa，分析纯）：加拿大 Fermentas公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA，生物试剂）：杭州微生物试剂有限公司；0.9%氯化钠注射液（生物试剂）：广西裕源药业有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（JA3003B）：上海精天电子仪器有限公司；温控水浴锅（8002）：北京永光明医疗仪器厂；电热恒温培养箱（101-4-S）：上海跃进医疗仪器厂；基础电泳仪（Power PacTM）：美国 Bio-Rad公司；质构仪（CT-3）：美国博勒飞公司；高速分散器（XHF-DF）：宁波新芝生物科技股份有限公司；真空包装机（DZ-600-2S）：双丰仪器制造公司；拉曼光谱仪（DXR2i）：赛默飞世尔科技。

1.3 鲢鱼鱼糕的制作工艺及操作要点

新鲜鲢鱼→剖杀→采肉（去鱼皮、红肉、鱼刺）→漂洗→擂溃→成型→蒸制→真空包装→4℃冰箱冷藏

1.3.1 剖杀

新鲜鲢鱼购买后，立即剖杀，去除头、尾、内脏，清洗干净。

1.3.2 采肉

去除鱼皮、红肉及鱼刺，并将鱼肉切分成小块。

1.3.3 漂洗

漂洗分3次，清水与鱼肉的比例为1∶5（质量比），最后一次漂洗时按照1.5 g/L的比例加入食盐，漂洗8 min～10 min，并不时搅拌，静置10 min后用纱布将鱼肉绞干。

1.3.4 擂溃

擂溃指将鱼肉斩剁成泥并与其它辅料混合均匀的过程。擂溃按照三阶段擂溃的方法，即空擂（5 min）、盐擂（加入食用盐2.5%～3.0%，15 min）及调味擂。其中调味擂时加入鸡蛋清5%，姜汁3%，葱白汁3%，豌豆淀粉8%，饮用水15%～25%。取少许鱼糜置于清水中，鱼糜能浮在水面上时即可终止擂溃。

1.3.5 成型

将鱼糜分为均匀小块，并处理成型，一般呈长方状。

1.3.6 蒸制

将成型鱼糜置于沸水蒸锅中蒸制30 min。

1.3.7 真空包装

将放至室温的鱼糕装入真空包装袋中，采用真空包装机进行封装。真空时间为14 s，热合时间为4 s。

1.3.8 冷藏

置于4℃冰箱中冷藏待用。

1.4 鱼糕的减菌处理

将鱼糕分为对照组（G）、超高压组（UG）和ClO2组（ZPG），G组即按以上操作进行；UG组在真空包装后进行500 MPa，120 s超高压处理；ZPG组处理方式为在真空包装袋内壁均匀涂抹3 mL浓度为10 mg/L的ClO2溶液再装入蒸制好的鱼糕，真空包装。

1.5 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定

TVB-N含量根据GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定。

1.6 菌落总数的测定

菌落总数根据GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数的测定》进行测定。

1.7 pH值的测定

pH值根据GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》进行测定。

1.8 持水性的测定

取2 g鱼糕搅碎，在离心机中离心（3 000 g，5 min），离心后称重，得到离心后的水分含量。

1.9 蒸煮损失率

从鱼糕上切下2 cm×2 cm×1 cm的小块，称重得W1，放入蒸煮锅中蒸煮5 min后冷却至室温，用吸水纸吸去表面水分再次称重得W2。

1.10 质构特性的测定

将4℃下保存的鱼糕切成2 cm×2 cm×2 cm的方块，使用CT-3质构仪测定鱼糕的质构特性。探头：TA5；测试类型：TPA；测试速度：5 mm/s；触发力：5 g。可得到硬度、弹性、咀嚼性、内聚性等参数。每组数据重复测试4次，取平均值。

1.11 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）电泳分析

SDS-PAGE的测定方法参考了Soottawat Benjakul等[9]，并进行了一些修改。使用均质机将3 g鱼糕与27 mL 溶解溶液（2%SDS，8 mol/L 尿素，pH8.8）混合。将匀浆后的样品在80℃水浴1 h以获得最大蛋白质溶解和提取，随后在3 000 g离心15 min，并将上清液用水稀释至0.2%蛋白质浓度。将处理的蛋白质样品（0.2%蛋白质浓度）与SDS-PAGE样品缓冲液（4%SDS，20%甘油，10%b-巯基乙醇，0.125 mol/L Tris，pH6.8）混合（以1∶1，体积比），并在沸水中加热溶解5 min待用。

电泳采用4%浓缩胶和10%分离胶，上样量为10 μL，在15 mA下进行电泳直至溴酚蓝条纹下降至分离胶和浓缩胶的分界线，将电流切换到25 mA。电泳结束后，使用考马斯亮蓝G-250染色液进行染色，然后使用考马斯亮蓝染色脱色液进行脱色处理，最后进行拍照。其中，考马斯亮蓝G-250染色液的配方为0.5 g考马斯亮蓝G-250，甲醇500 mL，冰醋酸92 mL，蒸馏水408 mL。脱色液配方为冰醋酸75 mL，甲醇50 mL，蒸馏水875 mL。

1.12 拉曼光谱分析

使用赛默飞DRX激光共聚焦拉曼光谱仪测定。激光波长为785 nm，激光能量30 mW，光阑50 μm针孔。记录400 cm-1～4 000 cm-1的光谱信息。对于光谱分析中，载玻片用锡纸包裹，将少量鱼糕样品放置在载玻片上压平。样本分析进行3次平行。根据以前的报告对拉曼光谱进行了校正[10]。收集获得的信号使用OMNIC软件处理。

1.13 数据处理

所有结果均以平均值±标准偏差表示。采用Microsoft excel 2010和SPSS 17.0进行数据处理，并用O－rigin8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 TVB-N值

挥发性盐基总氮（TVB-N）是表征鱼类产品微生物腐败程度的一个重要指标。TVB-N主要是源于微生物的增长和内源酶的作用，使蛋白质降解及氨、次级产物、胺类和非蛋白含氮化合物的产生[11]。我国国标（GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》）要求贮藏期间淡水鱼和虾的TVB-N值应小于或等于20 mg/100 g。鱼糕贮藏过程中TVB-N变化趋势如图1所示。

图1 鲢鱼鱼糕贮藏期内TVB-N值的变化Fig.1 Changes of TVB-N value in the storage period of the kamaboko gels

经过不同处理后鱼糕的TVB-N在4.4 mg/100 g左右，随着贮藏天数的增加，所有组别的TVB-N呈现上升趋势。未处理样品在第14天时TVB-N达到20.1 mg/100 g，已经超过国家标准。ClO2处理组在贮藏前10天TVB-N值与对照组无显著差异（P＞0.05），10 d以后TVB-N值上升速度较无处理组开始放缓，19 d时并未达到20 mg/100 g，说明ClO2的抑菌效果在贮藏后期开始显现。超高压处理组TVB-N值上升速度在5 d后较另外两组显著降低（P＜0.05），在贮藏19 d时为 17.7 mg/100 g，显著低于 ClO2处理组（P＜0.05），说明超高压处理较ClO2处理能更好的减缓鱼糕在贮存期中的TVB-N的上升。

2.2 菌落总数

菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH值、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。水产制品菌落总数国家限量标准为≤106CFU/g。鲢鱼鱼糕贮藏期内菌落总数的变化见图2。

图2 鲢鱼鱼糕贮藏期内菌落总数的变化Fig.2 Changes of total plate count in the storage period of the kamaboko gels

所有样品的菌落总数均随贮藏时间的延长而增加，未处理组在第10天菌落总数达到5.11 lg（CFU/g），贮藏14 d时未处理组菌落总数已经超过国家限量标准。ClO2处理组在贮藏第10天菌落总数显著低于未处理组（P＜0.05），但此时TVB-N值与未处理组没有差异，可能是因为微生物生长与导致TVB-N值的增加存在一定滞后，随着贮藏时间的进一步延长，ClO2处理组菌落总数较未处理组始终保持在较低水平，且贮藏19 d后超出国家标准。超高压组菌落总数在贮藏第5天显著低于未处理组（P＜0.05），TVB-N值则在第10天才与未处理组呈现显著差异，同样显示了菌落总数增长与TVB-N值增长之间有滞后效应存在，在后期贮藏过程中，超高压组菌落总数显著低于其他两个处理组，与TVB-N值变化趋势一致。

2.3 pH值

正常的鱼糕鱼丸类水产加工产品，其在贮藏期内的pH值变化不明显，一般在6.8～7之间。异常的pH值变化通常代表着微生物的大量增殖。腐败变质产生的典型终产物，氨和三甲胺大量积累导致pH值升高[12]。鲢鱼鱼糕贮藏期内pH值的变化见图3。

图3 鲢鱼鱼糕贮藏期内pH值的变化Fig.3 Changes of pH value in the storage period of the kamaboko gels

从试验结果中可以看到，未处理组鱼糕在贮藏的后期pH值上升，这是由于微生物的快速生长导致了鱼糕的腐败变质，ClO2和超高压处理组鱼糕的pH值在一个相对稳定的范围内波动。其pH值变化趋势并不明显，总体上呈现先略微下降后小幅度上升的趋势。由于两个处理组鱼糕中菌落总数在整个贮藏过程中增长速度相对较缓且都在标准范围以内，所以对于其pH值的影响较小。

综合以上结果，通过超高压和ClO2涂抹处理，均可明显的延长鱼糕的货架期，其中超高压处理效果更优。

2.4 持水力

鱼糕的持水力反映的是蛋白质与水的结合能力。在鱼糕中常作为一个品质评价指标。鲢鱼鱼糕在贮藏期内持水力的变化见图4。

图4 鲢鱼鱼糕在贮藏期内持水力的变化Fig.4 Change of WHC of the kamaboko gels

由图4可知，总体上各组持水力随着贮藏天数的增加而逐渐下降。一些研究者认为，持水力的下降是由于鱼糕凝胶网络稳定性的下降和其中水流动性的增长[13]。在贮藏过程中，内源酶和微生物的共同作用，可以使鱼糕中蛋白的降解造成蛋白网络结构被破坏，进而降低鱼糕的持水性。

未处理组持水力从第1天的92%下降至第10天的71%。而超高压组与ClO2处理组第10天时持水力分别为88.6%和87%，这主要是因为ClO2和超高压处理对微生物及内源酶的抑制所致。在贮藏初期超高压处理组的持水力明显高于其他组。原因是超高压处理可以增加鱼糕中蛋白间的氢键作用，稳定蛋白网络结构，使之可以容纳更多的水分子[14]。

因此，在持水力的保持上，超高压在贮藏初期能发挥更好的作用，但在贮藏后期则与ClO2处理组的效果相近。

2.5 蒸煮损失率

鱼糕的蒸煮损失率同样是鱼糕品质优劣的重要指标。鱼糕在贮藏期内蒸煮损失率的变化见图5。

图5 鱼糕在贮藏期内蒸煮损失率的变化Fig.5 Change of cooking loss of the kamaboko gels

试验结果表明，蒸煮损失率整体上呈现上升趋势。鱼糕中蛋白质之间形成的网络结构使水分被束缚在一定的范围和区域内，加热过程中蛋白聚集导致网络收缩，造成部分水分被“挤出”，产生蒸煮损失。随着贮藏期的延长蛋白结构展开可能会加剧其在加热过程中的聚集，进而造成更多的蒸煮损失[15-16]。

与未处理组相对比，整个贮藏过程中超高压组和ClO2处理组蒸煮损失率较低。原因是超高压处理可以使鱼糕网状结构变得更加致密，同时也进一步提升了蛋白质对水的束缚力[17]。ClO2组在贮藏过程中蒸煮损失率上升的速度也相对较缓。可能是由于减菌剂对微生物和内源酶的抑制作用减少了蛋白质的降解，更好的保持了鱼糕的蛋白结构的完整性。超高压组与ClO2处理组在整个贮藏过程中蒸煮损失率均为缓慢上升且差异不明显。因此，ClO2与超高压处理组均可有效的稳定鱼糕的蛋白结构进而降低蒸煮损失率。

2.6 质构（TPA）

质构数据可从多方面表现鱼糕的物理性质。硬度是人体对于触觉柔软坚硬的感觉，表征用来保持原有形状的内部结合力[18]。弹性则是指鱼糕变形后恢复原本形状的能力。内聚性是指分解鱼糕内部结合所需要的能量。而咀嚼性是指在咀嚼鱼糕过程中需要的能量[19]。鲢鱼鱼糕在贮藏期内质构的变化见图6。

试验结果显示，总体而言随着贮藏天数的增加，鱼糕质构指标呈现下降趋势，说明其质构品质逐渐劣变。整个贮藏过程中，UG组鱼糕质构指标均显著高于G组和ZPG组。原因在于超高压可能促进了鱼糕蛋白体系中氢键的形成；贮藏后期ZPG组的质构逐渐优于未处理组，与持水性变化规律一致。总体而言，鱼糕在贮藏过程中的品质发生劣变，这主要与蛋白的降解及构象变化有关，因此通过进一步研究贮藏过程中鱼糕中蛋白质变化规律，明确不同处理后鱼糕品质劣变机制的差异。

图6 鲢鱼鱼糕在贮藏期内质构的变化Fig.6 Change of TPA of the kamaboko gels

图7 鲢鱼鱼糕在贮藏期内SDS-PAGE电泳分析Fig.7 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the kamaboko gels during storage

2.7 鱼糕在贮藏期内SDS-PAGE分析

鲢鱼鱼肉的肌原纤维蛋白是一个比较复杂的蛋白体系。其中在SDS-PAGE分析中，几条较为明显的条带分别是，肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白和肌球蛋白轻链。其中肌球蛋白重链和肌动蛋白是最主要的蛋白条带。鲢鱼鱼糕在贮藏期内SDSPAGE电泳分析见图7。

由图7可知，随着贮藏期的延长，未处理组肌球蛋白重链出现一定程度的变浅，在贮藏期末尾，肌球蛋白重链已经明显浅于贮藏初期。说明在贮藏过程中肌原纤维蛋白发生了降解。随贮藏时间延长，超高压组肌球蛋白重链也发生了明显降解。说明超高压处理并不能使鱼糕中内源酶失活，贮藏过程中在内源性酶的作用下鱼肉蛋白发生了降解。在邱春江[15]的研究中发现，500 MPa的超高压处理超过10 min时，丝氨酸蛋白酶失活才会受到明显抑制，而在本试验中120 s的保压时间无法达到使内源性酶失活的作用。为进一步说明二氧化氯改善鱼糕品质的机制，增加了超高压与ClO2联合处理组，处理方式为在二氧化氯涂抹处理之后，进行超高压处理（500 MPa，120 s），再于 4℃保存。对比超高压+ClO2处理组与ClO2处理组，这两组肌球蛋白重链并未出现明显变浅。分析其原因是ClO2在一定程度上对鱼肉中内源性酶有失活作用。Benarde等[20]采用快速消毒取样法，结合分光光度法和同位素示踪法观察了ClO2对大肠杆菌的细胞壁和蛋白质合成的影响后指出，用ClO2处理细菌后其细胞内容物（蛋白质和核酸）没有渗漏出来，说明ClO2没有破坏细胞壁的完整性，而细胞合成蛋白质的过程却明显被抑制，说明二氧化氯对其内源性酶有抑制作用。由于肌球蛋白重链的分解是鱼蛋白质网状结构被破坏的重要原因之一。由此可以发现，ClO2的加入可以使内源性酶失活，有效地保持鱼肉的蛋白结构的完整性。

由此证明ClO2处理组延缓持水力、蒸煮损失率和质构特性劣变的主要原因是ClO2处理使内源性酶失活，从而保持了肌球蛋白重链和肌动蛋白的完整性。

2.8 鱼糕在贮藏期内的拉曼光谱分析

拉曼光谱是一种振动光谱技术，在分子结构的分析中运用广泛，是蛋白质构象研究的理想工具。水是很弱的拉曼光谱散射物质，因此无需考虑水分子的振动影响，因此拉曼光谱分析对样品的物理要求较低。鱼糕在贮藏期内拉曼光谱结果见图8～图10。

图8 G组贮藏期内的拉曼光谱图Fig.8 Raman spectra in the storage period of G group

图9 UG组贮藏期内的拉曼光谱图Fig.9 Raman spectra in the storage period of UG group

I850/I830比值大小则可以反映氢键结合和酪氨酸侧链酚羟基的离子化情况。当I850/I830的比值大于1时，表明酪氨酸残基在蛋白表面是暴露的，可作为氢键供体或受体而与溶剂水分子相互作用；当比值为0.7～1时，说明酪氨酸残基包埋在蛋白分子内部疏水环境中，可以作为氧键供体。由图8～图10可得，通过比较I850/I830强度，发现未处理组从第1天的1.07降至第15天的0.83，同样超高压处理组与ClO2处理组都有一定程度的下降，但下降程度较小。说明超高压处理和ClO2处理可以一定程度抑制酪氨酸残基的包埋，进而抑制了蛋白疏水性的增加，与持水性和蒸煮损失结果一致。相对于ClO2处理组，超高压处理组鱼糕在贮藏过程中酪氨酸残基始终暴露于亲水微环境中，只是随着贮藏时间的延长暴露程度有所降低，说明超高压可以促进蛋白中新的氢键形成，部分酪氨酸残基可能参与了氢键的形成而抑制了其包埋。

C-H 弯曲（1 440 cm-1～1 465 cm-1）峰值向低波长方向的横移则是由于烃类残基在蛋白质侧链上的疏水相互作用[21]。蛋白质使肽键主链相连接的氨基酸序列组成，其基本组成单位就是酰胺键，拉曼光谱中酰胺一带常被用来分析蛋白质的二级结构[22]。蛋白质的拉曼光谱可以获取酰胺键、碳链骨架伸缩振动谱带，从而得到蛋白质主链与侧链的构像信息，推测蛋白质二级结构的变化。位于1 600 cm-1～1 700 cm-1左右的范围的酰胺I带与蛋白质骨架构象类型相关，其主要涉及肽链C=O伸缩振动和N-H平面弯曲振动等。α螺旋集中于 1 650 cm-1～1 658 cm-1，β 折叠集中于 1 610 cm-1～1 640 cm-1，β 转角集中于 1 660 cm-1～1 700 cm-1，无规则卷曲集中于 1 640 cm-1～1 650 cm-1。

鱼糕二级结构含量由图11所示。

图11 贮藏过程中鲢鱼鱼糕二级结构相对含量Fig.11 Relative content of secondary structure of the Kamaboko gels during storage

研究表明新鲜鱼肉中α螺旋含量较高[15]，但从鱼糕二级结构来看，α螺旋与β折叠的含量都相对较低，说明二级结构偏向于无序化，这与其加工处理过程中的热处理有关[23]。从图11中，对比未处理组与超高压处理组，超高压处理组α螺旋和β折叠的相对含量更高，说明超高压处理组的有序化程度更高，这可能是由于超高压处理形成了新的氢键所致。由此可以解释在TPA指标，如硬度、弹性等超高压处理组较高的原因。而对比未处理组，ClO2处理组的二级结构与G组并无明显差异，说明ClO2处理组持水性、蒸煮损失等指标更有的原因主要在于其对蛋白亚基组分降解的抑制。

3 结论

1）鱼糕经过500 MPa，120 s超高压和10 mg/L ClO2处理后，保质期可以显著提高，冷藏19 d仍未超过国家相应标准，这主要是因为两种处理对微生物的抑制作用，相对而言超高压处理保鲜效果更优。

2）超高压和ClO2处理均能够提高鱼糕的持水性，降低鱼糕的蒸煮损失，改善鱼糕的质构品质，其中超高压处理后，鱼糕的质构指标改善更加明显。

3）除了对微生物的抑制外，两种处理对于鱼糕品质的改善机制有所不同，超高压处理后鱼糕蛋白分子间可以形成新的氢键，且结构较无处理组更加有序，进而使鱼糕的品质得到改善；ClO2处理改善鱼糕品质的原因则主要在于其对鱼糕中内源酶的抑制。