可同化氮浓度对蓝莓果酒生物胺及氨基甲酸乙酯的影响

雷霁卿，张放，杨金川，刘灵，马立志，*

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州贵阳550005；2.贵阳职业技术学院，贵州贵阳550005；3.贵州省产品质量监督检验局，贵州贵阳550005）

蓝莓（Semen Trigonellae）又称越橘，其果实呈蓝色，VC、多酚及花色苷等营养物质含量丰富，但蛋白质含量较低[1]。随着近年来蓝莓种植面积在我国逐渐扩大，使用蓝莓酿造蓝莓果酒成为研发蓝莓深加工产品的一个热点，而改善由于氮缺乏而引起的酒精发酵困难是目前蓝莓果酒酿造过程中急需解决的关键问题。

在酒精发酵过程中，酵母优先利用的氮源为铵态氮、游离 α-氨基酸（free amino nitrogen，FAN）和小分子多肽，被称为酵母可同化氮素（yeast-assimilable nitrogen，YAN）[2-4]。过去的研究表明，低水平的 YAN（低于140 mgN/L）会降低酵母生长活性，从而导致葡萄酒发酵缓慢。为了解决这个问题，磷酸氢二铵（diammonium hydrogen phosphate，DAP）和游离 α-氨基酸（FAN）通常用作葡萄酒发酵活化剂。两者作为直接的氮源添加剂会影响发酵过程中氨基酸代谢，从而导致生物胺、氨基甲酸乙酯、高级醇等发酵产物的含量受到影响[5-7]。生物胺不仅是评估果酒新鲜度和质量的指标，高含量生物胺可能会引起不良生理影响，如头痛，低血压，水肿和心悸等[8]，高浓度氨基甲酸乙酯则会导致胃肠道疾病并有致癌风险[9-10]。因此，这些副产品的产生在酿造过程中非常重要。本研究采用贵州麻江种植蓝莓为原料，比较不添加可同化氮果酒，添加不同浓度、不同种类可同化氮果酒中生物胺和氨基甲酸乙酯的含量差别，以期了解补充可同化氮对蓝莓果酒安全性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 新鲜蓝莓

采于贵州省麻江县蓝莓种植基地，选取成熟度一致、大小均匀、无病虫害、表皮无破损的蓝莓果实进行果实可同化氮的测定，选取可同化氮含量最少的品种进行实验；酿酒酵母1203：中国食品发酵工业研究所。

1.1.2 试剂

麦芽汁培养基：上海博微生物科技有限公司；焦亚硫酸钾：上海麦克林；磷酸氢二铵、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化钠、正丁醇、三氯乙酸：生工生物工程股份有限公司；氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯、组胺盐酸盐、色胺、尸胺、酪胺盐酸盐、苯乙胺、腐胺、精胺、亚精胺、1，7-二氨基庚烷及丹磺酰氯（标准品）、正己烷、乙腈、乙酸、乙酸胺、乙酸乙酯、乙醚、甲醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷（色谱纯）：美国西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氨比色分析试剂盒（K740）：BioVision，Inc.；Cleanert EC氨基甲酸乙酯专用固相萃取柱：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-25数显酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；糖度计：日本atogo公司；气浴恒温振荡器（THZ-92B气浴恒温震荡摇床）：上海博迅实业有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪、240-MS气相色谱-质谱仪：安捷伦科技有限公司；Agilent J&W DB-HeavyWAX气相毛细管色谱柱、ZORBAX Eclipse Plus C18液相色谱柱：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总氮的测定

蓝莓果实总氮的测定参照国标GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定。

1.3.2 铵态氮的测定

蓝莓果实铵态氮的测定使用Ammonia Colorimetric Assay Kit K470。

1.3.3 游离氨基酸的测定

蓝莓果实游离氨基酸测定参照Vilanova M等的方法进行[6]。

1.3.4 可同化氮添加方案

1.3.4.1 单添加可同化氮

蓝莓果实测定游离氨基酸与铵态氮浓度之后，选择游离氨基酸种类及数量最少的一种果实作为发酵原料，以磷酸氢二铵（DAP）作为可同化氮源分别添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 进行发酵，相应发酵果酒分别编号为FCK、F1D、F2D、F3D、F4D、F5D、F6D；以游离氨基酸（FAN）作为可同化氮源分别添加0、130、270、400、540、670、800 mgN/L 进行发酵，相应发酵果酒分别编号为 FCK、F1A、F2A、F3A、F4A、F5A、F6A；氨基酸参照蓝莓果实本身所含有的种类及其比例进行添加[6]。

1.3.4.2 二次添加可同化氮的方案

一组发酵液添加DAP使其可同化氮浓度为270 mgN/L，发酵至第4天时再次添加130 mgN/L FAN使发酵液总添加可同化氮浓度达到400 mgN/L；一组发酵液添加铵态氮使其可同化氮浓度为400 mgN/L，发酵至第4天时再次添加140 mgN/L FAN使发酵液总添加可同化氮浓度达到400 mgN/L；一组发酵液添加FAN使其可同化氮浓度为270 mgN/L，发酵至第4天时再次添加130 mgN/L DAP使发酵液总添加可同化氮浓度达到400 mgN/L；一组发酵液添加FAN使其可同化氮浓度为400 mgN/L，发酵至第4天时再次添加140 mgN/L DAP使发酵液总添加可同化氮浓度达到400 mgN/L；以上4组发酵果酒相应编号为F1DA、F2DA、F1AD、F2AD；氨基酸参照蓝莓果实本身所含有的种类及其比例进行添加[6]。

1.3.5 果酒发酵方法

参照张卿等[11]的方法进行酵母培养与果酒发酵。

1.3.5.1 活化酵母

将冻存酵母菌在37℃融化，接种在5°Bx的麦芽汁培养基中活化，酵母与麦芽汁培养基的比例为1∶5，放在空气恒温振荡器中28℃活化3 d，然后每天进行传代，连续3 d，使酵母处于活跃状态。

1.3.5.2 发酵流程

选取成熟度一致、大小均匀蓝莓洗净→热烫→匀浆→调配（pH=3.5，糖度=22°Bx）→添加偏重亚硫酸钾灭菌→按比例接种酵母→添加可同化氮→恒温28℃摇床培养3 d→暗处放置→过滤→酒精度与糖度的测定确定发酵结束。

1.3.6 氨基甲酸乙酯与生物胺的测定

果酒发酵14天后，放置于避光恒温培养箱20℃低温陈酿1个月后，测定氨基甲酸乙酯及生物胺含量。氨基甲酸乙酯含量的测定参照国标GB 5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》。生物胺含量的测定参照国标GB 5009.208-2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》。

2 结果与分析

2.1 蓝莓果实总氮、铵态氮及游离氨基酸的测定

采集贵州麻将地区粉蓝、园蓝、灿烂共三个品种蓝莓果实，进行果实总氮含量、铵态氮含量、游离氨基酸含量及可同化氮含量的测定，见表1。

由表1试验结果可知，园蓝总氮[（389.920 0±4.525 5）mgN/L]及可同化氮[（97.469 1±0.493 9）mgN/L]含量最高，但游离氨基酸含量最低[（25.125 7±0.046 6）mgN/L]，进一步测定果实中游离氨基酸种类，结果见表2。

由表2可知，3个品种蓝莓果实均不含有赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro），其中，园蓝蓝莓果实还缺少蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）。

贵州地区蓝莓果实可同化氮含量均低于100 mgN/L，因此添加可同化氮进行蓝莓果酒发酵可提高发酵效率，但可同化氮含量过高会伴随生物胺及氨基甲酸乙酯的产生。氨基甲酸乙酯是发酵过程中乙醇与尿素、瓜氨酸自发反应生成，生物胺是酵母所产生的氨基酸脱羧酶将前体氨基酸脱羧产生，两者的产生与初始发酵液中可同化氮浓度，氨基酸种类与数量关系密切[5-6]。为进一步研究添加可同化氮种类及浓度对蓝莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影响，选择氨基酸含量及种类最少的蓝莓品种（园蓝）作为发酵原料，采用DAP与FAN作为可同化氮源，进行果酒发酵。

表1 不同蓝莓果实可同化氮含量Table1 Concentration of assimilation nitrogen in different kinds of blueberry mgN/L

表2 不同蓝莓果实游离氨基酸相对含量Table2 The relative content of free amino acids in different kinds of blueberry %

2.2 可同化氮浓度对蓝莓果酒氨基甲酸乙酯的影响

测定分别添加不同浓度DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量，试验结果如图1所示。

随初始发酵液中可同化氮浓度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，DAP作为氮源的蓝莓果酒中氨基甲酸乙酯生成量随可同化氮浓度增加迅速上升，在DAP浓度800mgN/L时可达到26.5μg/L，但仍小于国家限定标准（≤30 μg/L）；添加FAN作为氮源的蓝莓果酒氨基甲酸乙酯的生成量随可同化氮浓度增加而增加（1.53 μg/L～2.359 5 μg/L）；可同化氮浓度 130 mgN/L时，DAP或FAN果酒中氨基甲酸乙酯含量差别不大，但持续增加可同化氮浓度，添加DAP果酒中氨基甲酸乙酯含量远高于添加FAN果酒（图1）。为进一步探索可同化氮种类及含量对氨基甲酸乙酯的影响，进行二次混合添加发酵试验发现，二次添加可同化氮的蓝莓果酒均未检测到氨基甲酸乙酯。

图1 可同化氮浓度对蓝莓果酒氨基甲酸乙酯含量的影响Fig.1 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of ethyl carbamate of blueberry wine

图2 可同化氮浓度对蓝莓果酒生物胺含量的影响Fig.2 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of biogenic amine of blueberry wine

C.Adams等采用不同酵母株接种添加不同浓度DAP的葡萄汁进行发酵后发现，可同化氮浓度对葡萄酒氨基甲酸乙酯含量的影响，取决于酵母菌株及添加可同化氮的时机：采用酿酒酵母522进行发酵，则随着DAP浓度增高，葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量增高；采用Pasteur Red酵母进行发酵，则添加DAP反而使葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量减少；另外，采用酿酒酵母522进行发酵时，初始发酵液添加DAP的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量高于发酵开始后添加DAP的葡萄酒，采用Pasteur Red酵母进行发酵则试验结果相反[12]。张颖等采用葡萄酒高活性干酵母进行模拟葡萄汁发酵发现添加DAP可使氨基甲酸乙酯含量降低，而添加氨基酸可使氨基甲酸乙酯含量升高[13]。本研究显示，采用酿酒酵母1203进行蓝莓果酒发酵，随初始发酵液中可同化氮浓度升高，果酒中氨基甲酸乙酯含量随之增加，其他酵母菌种进行发酵是否也会使添加可同化氮蓝莓果酒氨基甲酸乙酯含量升高有待深入研究。

2.3 可同化氮浓度对蓝莓果酒生物胺的影响

通过液相色谱测定果酒中生物胺种类及数量结果如图2所示。

蓝莓果酒生物胺苯乙胺、尸胺、组胺和精胺未检出，色胺、腐胺、酪胺和亚精胺均有检出，但酪胺与亚精胺相对含量较低。未添加可同化氮果酒中生物胺总含量最高，添加DAP或/和FAN使可同化氮浓度增加可有效减少生物胺的形成，二次添加可同化氮果酒生物胺总含量显著高于相同浓度单次添加可同化氮的蓝莓果酒[F1DA：（125.602 8±0.285 0）mg/mL、F1AD：（130.818 5±6.432 1）mg/mL、F3D：（27.844 2±0.586 9）mg/mL、F3A：（92.690 2 ±0.935 0）mg/mL；F2DA（101.5040±2.3550）mg/mL、F2AD（130.866 8±3.145 9）mg/mL、F4D：（94.084 8±1.694 0）mg/mL、F4A：（67.1349±0.2586）mg/mL]。

进一步研究个别生物胺的含量变化，结果如图3。

较添加FAN而言，添加DAP可更显著降低色胺、亚精胺含量（图3A、3D）；添加低浓度DAP果酒中腐胺含量低于添加低浓度YAN果酒，添加浓度超过400 mgN/L后，添加DAP果酒中腐胺含量急剧增加，添加YAN果酒则急剧下降（图3B）；添加YAN可显著降低酪胺含量，添加DAP浓度超过400 mgN/L时，酪胺含量大幅升高，可达（5.6032±0.1813）mg/mL（图 3C）。

葡萄酒可检出超过20种生物胺，主要含组胺、腐胺、酪胺[14]。本研究蓝莓果酒中检出色胺、腐胺、酪胺和亚精胺，以色胺和腐胺为主，果酒种生物胺含量及种类少于葡萄酒。比较蓝莓果实与葡萄果实可知，葡萄汁含有至少18种游离氨基酸[1]，而园蓝蓝莓汁只含有11种游离氨基酸，缺少赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）等氨基酸（表二），而生物胺含量与食品中存在的游离氨基酸关系密切[14-15]，故蓝莓果酒生物胺种类与葡萄酒存在差异可能与游离氨基酸差别有关。同时，研究认为苹果酸-乳酸发酵发酵过程中产生了大量的生物胺，乳酸菌种类决定了添加可同化氮果酒中生物胺含量的增加或减少[14，16]，进一步分离研究蓝莓果酒苹果酸-乳酸发酵过程中乳酸菌生理生化及发酵特性或许有助于揭示蓝莓果酒生物胺变化规律的内在机制。

图3 可同化氮浓度对蓝莓果酒各生物胺含量的影响Fig.3 The effect of assimilation nitrogen concentration on the content of different kinds of biogenic amine in blueberry wine

3 结论

本研究以蓝莓果实为原材料，通过初始单添加不同浓度DAP或FAN以及二次混合添加DAP和FAN进行果酒发酵试验，首次探索了添加不同浓度、不同种类可同化氮对蓝莓果酒中生物胺及氨基甲酸乙酯含量的影响。研究结果显示，随初始发酵液中可同化氮浓度增加，果酒中氨基甲酸乙酯含量升高，添加DAP果酒氨基甲酸乙酯含量显著高于添加FAN果酒；二次添加果酒未检测到氨基甲酸乙酯；随初始发酵液中可同化氮浓度增加，果酒中生物胺含量减少，添加DAP果酒生物胺含量低于添加FAN果酒，单添加果酒生物胺含量低于二次添加果酒。本研究认为蓝莓果酒发酵添加可同化氮有助于降低生物胺含量，同时可同化氮添加浓度低于800 mgN/L时，果酒中氨基甲酸乙酯含量均符合国家安全限量标准。研究结果为进一步揭示可同化氮对蓝莓果酒安全性影响及制定蓝莓果酒可同化氮添加标准提供了依据。