灯盏乙素对阿尔茨海默病小鼠脑组织β分泌酶途径相关蛋白表达的影响

王豫君，敖俊文，郭莉莉，于燕妮

(1贵州医科大学，贵阳550004；2贵阳市第一人民医院)

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统变性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响患者的生活和社交功能。β淀粉样肽(Aβ)在AD的发病过程中起重要作用，延缓或阻止Aβ沉积所致的神经元机能衰退及神经毒性是治疗AD的研究方向之一[1]。β分泌酶途径是Aβ病理性沉积中β淀粉样前体蛋白(APP)代谢的主要途径， 分泌酶作为Aβ产生的重要限速因子，能够特异靶向膜结合底物，启动Aβ的生成[2]。灯盏乙素(Scu)是灯盏细辛的药理活性成分。研究显示，Scu能够减轻痴呆大鼠神经型尼古丁受体蛋白表达和胆碱酯酶活性异常所致的胆碱能系统功能损害[3]；消除自由基的产生，提高机体抗氧化能力[4]；抑制炎性因子释放、减轻神经炎症损伤[5]；抑制神经细胞凋亡，对抗Aβ的毒性[6]。2015～2017年，我们将类AD动物模型APPswe/PS1dE9双转基因小鼠做为研究对象，观察Scu对β分泌酶的裂解活性物质β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、BACE2以及总APP表达的影响，探讨药物干预APP代谢的β分泌酶途径来抑制Aβ生成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 3月龄APPswe/PS1dE9双转基因阳性小鼠40只，3月龄背景品系C57BL/6J小鼠10只，雌雄各半，由中国医学科学院实验动物所遗传中心提供，动物实验经贵阳市第一人民医院动物伦理委员会批准。Scu由南京泽朗生物医药科技公司提供，高效液相色谱(HPLC)法鉴定纯度大于98%。多克隆抗BACE1抗体(美国GENETEX公司)；抗β-actin抗体(美国CST公司)；多克隆抗APP、BACE2抗体(美国Abcam公司)；SYBR Green PCR 试剂盒(美国KAPA Biosystems公司)；逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)；APP、BACE1、BACE2和内参照β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成购得。实时荧光定量 PCR 仪(美国BIO-RAD公司)；MK30酶标仪(芬兰雷柏公司)；Centrifuge 5424 R离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 动物分组与处理 将APPswe/PS1dE9小鼠随机分为模型组和Scu低、中、高剂量组各10只，C57BL/6J小鼠作为正常对照组。小鼠进入SPF级实验室，分笼分性别饲养，每笼5只，普通繁殖饲料饲养。药物剂量根据患者临床用量的等效剂量和动物体表面积折算所得，Scu低、中、高剂量组分别给予Scu 1.5、2.5、4.0 mg/(100 g·d)灌胃，正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日上午9点给药，连续90 d。

1.3 学习记忆能力测试 采用Morris水迷宫实验。治疗结束后第1～4天进行定向航行实验，记录60 s内小鼠从不同象限入水到爬上平台(固定于第1象限)所需时间，即逃避潜伏期。每天连续测试4次，取平均值。第5天撤去平台，进行空间探索实验，记录小鼠第1次穿越原站台时间及1 min内穿过原站台位置的次数。

1.4 标本采集 Morris水迷宫实验完成后，将小鼠断颈处死，剥离脑组织，置于-80 ℃冻存，用于APP、BACE1、BACE2蛋白及mRNA检测。

1.5 脑组织中APP、BACE1、BACE2蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组脑组织，加入蛋白裂解液，冰上匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清进行蛋白质定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白质转移至PVDF膜上，加入8%脱脂奶粉封闭。分别与一抗(APP、BCAE1、β-actin按1∶1 000稀释，BACE2按1∶500稀释)和二抗(按1∶10 000稀释)孵育后曝光显影，定影。用Image J软件对胶片进行灰度扫描得出条带像素灰度值。以β-actin蛋白条带作为内参照，计算目的蛋白与β-actin蛋白条带像素灰度的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.6 脑组织中APP、BACE1、BACE2 mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。用TRIzol试剂提取脑组织总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，β-actin为内参进行扩增。引物序列：APP上游5′-ACTGCCAAGAGGTCTA-3′，下游5′-GGTAAGGAATCACGAT-3′；BACE1上游5′-ATGGCTTTTGGCTAG-3′，下游5′-CGGAAGGACTGATTG-3′；BACE2上游5′-CTGGTGATTGGTGCG-3′，下游5′-TTCCGTGGAAAAGGG-3′；β-actin上游5′-CCCATCTACGAGGGCTAT-3′，下游5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。扩增体系：总体积20 μL，其中SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，共39个循环。应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 各组学习记忆能力比较 见表1、2。与正常对照组相比，模型组在定向航行中逃避潜伏期时间延长，第1次穿越平台时间明显延长，平台穿越次数减少(P均<0.01)；与模型组比较，Scu高剂量组逃避潜伏期时间缩短，第1次穿越平台时间缩短，平台穿越次数增多(P均<0.01)。Scu中、低剂量组与模型组比较无统计学差异(P均>0.05)。

表1 各组定向航行实验中逃避潜伏期时间比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

表2 各组第1次穿越平台时间和平台穿越次数比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 各组脑组织中APP、BACE1、BACE2蛋白表达比较 见表3。与正常对照组比较，模型组脑组织中APP、BACE1蛋白表达升高，BACE2蛋白表达下降(P均<0.05)；与模型组比较，Scu高剂量组脑组织中APP、BACE1蛋白表达下降，BACE2蛋白表达升高(P均<0.05)，Scu中、低剂量组各指标无明显变化(P均>0.05)。

表3 各组脑组织中APP、BACE1、BACE2蛋白表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组脑组织中APP、BACE1、BACE2 mRNA表达比较 见表4。与正常对照组比较，模型组脑组织中APP、BACE1 mRNA表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，Scu高剂量组脑组织中APP、BACE1 mRNA表达降低(P均<0.05)，Scu中、低剂量组无明显变化(P均>0.05)。各组BACE2 mRNA表达比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表4 各组脑组织中APP、BACE1、BACE2 mRNA表达比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

Aβ沉积在相关脑区是AD的病理学特征之一。在AD发病机制的众多学说中，“Aβ级联学说”一直占主导地位[7]。该学说认为，Aβ的异常聚集可产生一系列神经毒性作用，诱发胆碱能功能障碍、神经炎性反应、氧化应激产生、线粒体功能障碍、突触损害等，这些神经毒性反应相互作用形成环形事件，最终导致神经细胞凋亡，引发痴呆[8]。有研究认为，Aβ是AD的结果而不是起因，Aβ的生成是神经元损伤的非特异性反应，这种损伤导致了APP的表达增多，出现Aβ沉积[9，10]。研究证实，AD的病程与Aβ状态、分布、性质的改变有关，Aβ寡聚体的毒性和Aβ沉积均可造成大脑结构的破坏；而且Aβ能够在细胞间传递，而细胞内Aβ异常聚集与认知功能障碍直接相关[11，12]。因此寻找对抗Aβ沉积所致的学习记忆能力损害的药物，在AD治疗中具有重要意义。

Aβ由APP在代谢过程中产生。参与APP代谢的主要有α、β、γ分泌酶，α分泌酶主导的是非Aβ生成途径，此途径不产生完整的Aβ片段，被广泛认为是有益的，能够阻碍Aβ的形成；而β分泌酶主导的是病理条件下Aβ的生成，可形成大小不等的Aβ肽，以Aβ1-42的毒性最强。目前已知的β分泌酶主要包括BACE1及组织蛋白酶B、D、L等，其中BACE1主要分布于神经元细胞，在Aβ级联学说中占重要地位，被视为AD防治药物的重要靶点。BACE1所有的底物都是跨膜蛋白，APP为Ⅰ型跨膜蛋白，是BACE1的主要底物。BACE1在β位点处将APP肽段切开后产生一段β可溶性分泌型APP片段(sAPPβ)和一段含有完整Aβ的片段(C99)，后者再经过γ分泌酶裂解得到相对分子质量约为4 kD的可溶性Aβ片段(Aβ1-38、Aβ1-40、Aβ1-42等)，此途径也被称为Aβ生成的β分泌酶途径。当BACE1过度表达时，细胞内的β分泌酶活性增强，Aβ分泌增多，加速神经元的损伤。目前，BACE1高表达和活性增强已成为诊断AD的一个重要生化指标[13]。研究表明，降低或敲除BACE1基因均可显著减少Aβ的沉积[14]。BACE2具有与BACE1高度相似的氨基酸序列，同样在β酶切位点对APP进行切割，不同的是，其主要分布于星型胶质细胞内，切割部位主要在Aβ区域内，不产生沉积的Aβ片段，不仅能降低脑组织中Aβ的沉积，还能对BACE1的切割作用进行竞争性的抑制，阻止Aβ的产生。值得一提的是，BACE2 mRNA在大多组织中都是低水平表达[15]，脑组织中也是如此。

研究证实，APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠可在短时间内出现类AD的病理改变，脑组织中高表达APP和BACE1，Aβ过量产生，小鼠的学习记忆功能受损，并随年龄增加，这些改变逐渐加重[16]。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组脑组织中APP、BACE1表达在蛋白和mRNA水平均明显升高；模型组BACE2蛋白表达下调，而BACE2 mRNA表达无明显改变，这可能与其mRNA在脑组织中表达量处于极低水平有关，差异性不明显可能由于该基因表达不在于转录水平的改变而在于翻译后修饰。考虑到是长期给药，实验在药物剂量设定上有所保留，中、低剂量组虽有改善趋势，但未能显示出统计学差异。

研究表明，Scu能够对抗与Aβ毒性相关的痴呆大鼠学习记忆能力下降[17，18]。本研究着眼于Scu对Aβ生成途径的干预，结果显示，Scu高剂量组脑组织中APP、BACE1蛋白和mRNA水平较模型组降低，BACE2蛋白及mRNA水平较模型组升高，提示Scu可能通过降低β分泌酶的活性，减少BACE1对总APP的切割，在一定程度上阻止β分泌酶主导下的APP代谢，减轻Aβ沉积带来的学习记忆损害。

综上所述，Scu能够调节AD模型小鼠Aβ生成途径中主要因子APP、BACE1蛋白和mRNA以及BACE2蛋白表达，通过干预APP代谢的β分泌酶途径来抑制Aβ生成。