原发性肝癌患者癌旁组织中GP73、GPC3蛋白表达及意义

金涛，何前进，毛伟明，张喜华，岑红兵

(1华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077；2黄冈市中心医院)

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均位居世界首位[1]。目前肝癌的治疗主张手术为主的综合治疗。近年来，尽管肝脏外科有了长足发展，但肝癌术后复发率和转移率仍较高。如果能提前预测和较早地发现、处理肝癌的复发和转移灶，可延长患者的生存时间，部分患者还可能因此彻底治愈[2,3]。目前报道的肝癌预后预测标记物很多，但绝大部分都是围绕肝癌组织进行的。近年研究发现，癌旁组织在肝癌的复发和转移中也起着决定性的作用[4]。高尔基体蛋白73(GP73)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是继AFP之后发现的新的肝癌血清诊断标志物，除了能诊断肝癌外，二者在肝癌组织中的表达与肝癌患者的预后密切相关[5～9]。而GP73和GPC3在癌旁组织中的表达是否也能用于判断肝癌患者的预后目前少见报道。本研究通过检测原发性肝癌患者癌旁组织中GP73、GPC3蛋白的表达情况，探讨二者对肝癌切除术后患者预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2008～2015年在湖北省黄冈市中心医院接受肝癌根治术的原发性肝癌患者106例，男89例、女17例，年龄28～72岁、平均48.9岁。均经术后病理检查确诊。患者HBsAg均阳性，HCV、HIV抗体均阴性，术前均未接受过放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。收集患者术后的癌旁组织(距离肝癌组织大于2 cm)。另选择10例肝血管瘤患者，HBsAg、HCV、HIV均阴性，取距血管瘤3 cm以上的正常肝组织。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 癌旁组织和正常肝组织中GP73、GPC3蛋白表达检测 采用免疫组化染色法。将收集的癌旁组织和正常肝组织用石蜡包埋，切片，脱蜡至水，PBS清洗。加入3% H2O2溶液中室温孵育15 min，PBS洗涤。将切片置入pH 9.0的缓冲液中，微波抗原修复。滴加封闭液(10%的山羊血清)，室温静置2 h。弃封闭液，滴加一抗(GP73单克隆抗体1∶300的稀释，GPC3单克隆抗体1∶250的稀释)，4 ℃过夜。滴加生物素化的二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗涤。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素室温孵育15 min，PBS洗涤。DAB显色，自来水中止反应。采用PBS代替一抗作为阴性对照。GP73和GPC3的阳性细胞百分比<1%为0分，1%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分；细胞染色棕褐色为3分，棕黄色为2分，黄色为1，无色为0分。两者相加0～1分为阴性，≥2分为阳性；2～3分为低表达，≥4分为高表达。

1.3 患者随访方法 患者术后每3个月复查1次，随访至2018年2月，记录患者总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，判断相关性采用Pearson相关系数法；非正态分布资料比较采用Mann-Whitney检验。采用Kaplan-Meier法分析患者生存情况。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌旁组织中GP73和GPC3蛋白阳性表达情况 癌旁组织中GP73蛋白的阳性表达率为48.1%(51/106)，GPC3蛋白的阳性表达率为32.1%(34/106)，二者均以胞质染色为主。正常肝组织中GP73和GPC3蛋白均为阴性表达，与癌旁组织相比有统计学差异(P均<0.05)。

2.2 不同临床病理特征患者癌旁组织中GP73和GPC3表达比较 见表1。合并肝硬化和血管侵犯患者癌旁组织中GP73蛋白的阳性表达率高于未合并肝硬化和血管侵犯患者，合并血管侵犯患者癌旁组织中GPC3蛋白的阳性表达率高于未合并血管侵犯患者(P均<0.05)。

表1 不同临床病理特征的肝癌患者癌旁组织中GP73和GPC3表达比较(例)

2.3 癌旁组织中GP73、GPC3表达与患者预后的关系 Kaplan-Meier生存分析显示，癌旁组织GP73和GPC3蛋白阳性表达的患者预后较差(P<0.05)。其中GP73高表达和低表达患者OS分别为(27.5±3.7)、(53.6±4.1)个月(P=0.000)；PFS分别为(20.9±4.3)、(44.2±6.9)个月(P=0.012)。GPC3高表达和低表达患者OS分别为(34.7±5.2)、(48.5±4.8)个月(P=0.010)；PFS分别为(25.7±6.4)、(40.1±5.5)个月(P=0.001)。COX单因素和多因素回归分析显示，肝癌癌旁组织中GP73 和GPC3高表达是肝癌术后OS和PFS不良的独立预后因素(P均<0.05)。

3 讨论

肝癌是一个较易复发和转移的恶性肿瘤，其复发和转移除了同肝癌细胞自身的恶性程度及生物学行为密切相关外，还与肿瘤生长的土壤即癌旁微环境密切相关[4]。文献[5，6]报道显示，肝癌癌旁组织中PD-L1、EpCAM等蛋白的高表达与肝癌的预后不良密切相关。本研究发现，肝癌癌旁组织中GP73和GPC3蛋白表达也与患者的预后密切相关。

GP73是一种整合膜蛋白。疾病状态下，GP73可从高尔基体顺面膜囊上释放到胞质，胞质中被蛋白转化酶酶切，然后通过内涵体运输，释放到胞外，进入血液。研究发现，GP73的表达和肝脏疾病关系密切，正常肝组织中大部分肝细胞不表达GP73，仅有少量的肝细胞低表达GP73，而GP73在肝炎、肝硬化组织中表达却明显增高，在肝癌组织中表达最高[7]。文献[8，9]报道，肝癌组织中GP73高表达的患者预后较差，生存时间较短。本研究发现，GP73在10例正常肝组织中均为阴性表达，这与既往的文献[8～12]报道相一致。而GP73在48.1%癌旁组织中呈阳性表达，这可能与癌旁组织通常为肝炎或肝硬化组织有关。癌旁组织中GP73蛋白高表达的患者预后较差，并且癌旁组织中GP73蛋白表达与肝硬化及血管侵犯密切相关，在肝硬化的癌旁组织中的表达高于非肝硬化的癌旁组织,同时癌旁高表达GP73的患者较易出现肿瘤组织的血管侵犯。

GPC3在胎盘、胚胎肝、胚胎肺和胚胎肾中均有表达，但在成人的正常肝、肺、肾中均无表达。它的Arg(358)和Ser(359)间分裂产生可溶性GPC3，在肝癌患者血清中特异性升高，可作为肝癌的诊断标记物[13]。在一段时间内，GPC3一直被作为肝癌的血清标记物加以研究，最近的研究发现，GPC3同肝癌的预后密切相关，GPC3高表达的患者预后较差[10～12]。有研究显示，GPC3可通过激活Wnt/β-catenin通路促进肝癌细胞的生长[14]。针对GPC3的多肽疫苗还可抑制肝癌患者肿瘤的生长[15]。本研究发现，GPC3在被检测的正常肝组织中均为阴性表达，而在32.1%的癌旁组织中呈阳性表达。癌旁组织中GPC3的表达对患者的预后也有预测价值，GPC3高表达患者无论是OS还是DFS均明显差于GPC3低表达的患者，并且GPC3可作为预测肝癌患者术后OS和DFS的独立危险因素。

综上所述，肝癌术后应同时对肿瘤组织和癌旁组织进行相关基因的检测，对较易复发和转移的患者，如癌旁组织中GP73和GPC3过表达者，应密切随访和积极干预，从而巩固手术疗效，延长肝癌患者的生存时间。