极化液和丙酮酸钠联合治疗严重烫伤多器官功能不全综合征大鼠实验研究

钟 莹,王占科,周方强,胡 添,王庆莅,郭 靓

多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是指在严重创伤、感染和休克后，伤前无器官功能不全患者同时或相继出现2个或2个以上器官功能不全的综合征[1-2]。严重烧(烫)伤作为严重的创伤，并发MODS涉及全身性感染炎症反应、氧化应激及糖代谢紊乱导致的高血糖和高乳酸血症，晚期病死率高，是住院烧伤患者死亡的主要原因，早期发现和综合干预创伤后MODS是降低住院患者病死率的有效手段[3-6]。文献报道，胰岛素和丙酮酸乙酯均具有抗炎和抗氧化作用,且联合治疗较单独治疗效果好[7]。极化液主要成分为胰岛素、葡萄糖和氯化钾，是心血管内科一种传统药物[8]。极化液和胰岛素不完全相同，丙酮酸钠和丙酮酸乙酯也有根本不同的性质，二者联合治疗严重创伤MODS实验研究报道较少。本研究探讨极化液和丙酮酸钠联合治疗严重创伤MODS作用机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 清洁级健康成年SD大鼠，体重(200±15)g，雌雄各半[江西中医药大学实验动物科技中心提供，动物生产许可证号SCXK(赣)2016-0001，质量合格证号1308116]；胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，规格：3.0 ml：300 U)；丙酮酸钠(美国sigma公司，分析纯)；内毒素[Lipopolysaccharide(LPS), E.coli O111:B4，美国sigma公司,分析纯]。血可溶性髓样细胞触发蛋白1(sTREM-1)和高迁移率族蛋白B1(HMGB-l)等炎性因子和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒均由美国Sigma公司生产。MDA化学比色法检测试剂盒和SOD检测试剂盒均购自福建新大陆生物技术股份有限公司。血糖(GLU)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血肌酐(CRE)和血肌酸激酶(CK)生化检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.2仪器 TDZ4B-WS型离心机从湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司购买；HH-W21型电热恒温水浴箱从上海医用恒温设备有限公司购买；JB-1型全自动快速立式洗板机从郑州基波新科技有限公司购买；BIO-RAD550型酶标仪购自美国伯乐BIO-RAD公司；BS2000型全自动生化分析仪由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产。

1.3动物模型制作和分组 80只清洁级健康成年SD大鼠无菌包装条件下，运输到解放军94医院动物实验室[实验室许可证SYXK(赣)2013-001]清洁级大鼠实验环境下适应性喂养3 d，烫伤前1 d进行尾静脉采血，然后根据参考文献[7]进行麻醉后背部剪毛，浸入(92.0±2.0)℃水中20 s，制作30%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤，伤后2 h按5 mg/kg体重腹腔注射内毒素(1.0 mg/ml,5.0 ml/kg)，同时腹腔注射生理盐水3.0 ml抗休克。烫伤大鼠伤后1 d并发肝功能、肾功能和心肌酶等指标明显高于伤前，并持续到伤后7 d，为创伤MODS模型制作成功。将制备后的严重烫伤内毒素血症MODS动物模型，按随机数字表法分为极化液治疗组(GIK组)、丙酮酸钠治疗组(SP组)、极化液和丙酮酸钠联合治疗组(GIK+SP组)及对照组,每组20只。

1.4给药剂量和途径 GIK组：参考文献[9]配制葡萄糖、胰岛素和氯化钾终浓度分别为100 g/L、80 U/L和5 g/L极化液治疗溶液，胰岛素和葡萄糖治疗剂量分别为5.6 U/(kg·d)和7.0 g/(kg·d),伤后6 h,腹腔注射1次，然后每8小时腹腔注射1次,连续7 d。SP组：用生理盐水配制丙酮酸钠终浓度为0.25 g/L的丙酮酸治疗液，按12.5 mg/(kg·d)治疗剂量，伤后6 h腹腔注射1次，然后每8小时腹腔注射1次,连续7 d。GIK+SP组：极化液和丙酮酸钠治疗剂量和治疗时间分别同GIK组和SP组，先腹腔注射丙酮酸钠溶液，随后注射极化液溶液。对照组：只注射生理盐水，其他同GIK组。各组大鼠雌雄比，伤前体重，喂食和饮水条件相同，腹腔注射溶液总体积相同，均为3 ml。丙酮酸钠溶液需临时配制，放冰箱4℃保存，配制后当天内使用。

1.5样品采集及测定指标 各组烫伤大鼠，参考文献[10]分别于伤前，伤后1、3、5和7 d进行尾静脉采血，采血前禁食8 h但可以自由饮水，肝素钠抗凝，离心后，分离血浆，-80℃超低温液氮罐内保存。标本相关指标检测时，各组血液标本统一冻融，严格按照各指标检测试剂盒说明书测定。空腹GLU、LA、ALT、CRE和CK及SOD测定采用酶法，血浆MDA测定采用化学终点比色法在全自动生化分析仪上进行测定。血浆sTREM-1和HMGB1采用ELISA检测法在酶标仪上进行测定。所有指标质控均在控，标本检测浓度在标准曲线的线性范围内。

2 结果

2.1大鼠存活情况 对照组大鼠伤后7 d存活14只，存活率为70%；SP组和GIK组伤后7 d均存活16只，存活率均为80%，GIK+SP组伤后7 d存活17只，存活率为85%。4组伤后7 d大鼠存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组大鼠伤后不同时间存活情况(只)

注：GIK组为极化液对照组，SP组为丙酮酸钠治疗组，GIK组+SP组为极化液和丙酮酸钠联合治疗组，对照组仅给予生理盐水

2.2大鼠GLU和主要脏器功能指标情况 4组伤后各时点GLU、ALT、CK和CRE高于伤前(P<0.01)，并持续到伤后7 d；GIK组、SP组和GIK+SP组伤后各时点ALT、CK和CRE均低于对照组，且GIK+SP组低于GIK组和SP组(P<0.01)；GIK+SP组和GIK组伤后各时点GLU低于SP组和对照组(P<0.01)，GIK+SP组和GIK组GLU比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组严重烫伤多器官功能不全综合征大鼠GLU、ALT、CRE和CK水平变化

注：GLU为血糖，ALT为丙氨酸转氨酶，CRE为血肌酐，CK为血肌酸激酶；GIK组为极化液治疗组，SP组为丙酮酸钠治疗组，GIK+SP组为极化液和丙酮酸钠联合治疗组，对照组仅给予生理盐水；与伤前比较，bP<0.01；与对照组比较，dP<0.01;与GIK组比较，fP<0.01；与SP组比较，hP<0.01

2.3血乳酸、丙酮酸水平变化 4组伤后各时点血LA、PA和LA/PA均高于伤前(P<0.01)，并持续到伤后7 d；GIK+SP组、GIK组、SP组伤后各时点血LA和LA/PA水平均低于对照组，且GIK+SP组伤后各时点LA和LA/PA水平低于GIK组和SP组(P<0.01)；GIK+SP、GIK、SP组伤后各时点血PA高于对照组(P<0.01)，但GIK+SP、GIK、SP组血PA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4大鼠血浆sTREM-1和HMGB1水平变化 4组伤后各时点血浆sTREM-1和HMGB1水平均高于伤前(P<0.01)，并持续到伤后7 d；GIK、SP和GIK+SP组伤后各时点血浆sTREM-1和HMGB1水平均低于对照组(P<0.01)，且GIK+SP组低于GIK组和SP组(P<0.01)。见表4。

2.5大鼠血浆MDA和SOD水平变化 4组伤后各时相点血浆MDA含量高于伤前，SOD低于伤前(P<0.01)，并持续到伤后7 d；GIK、SP和GIK+SP组伤后各时点血浆MDA含量均低于对照组，且GIK+SP组低于GIK组和SP组(P<0.01)；GIK、SP和GIK+SP组伤后各时点血浆SOD水平均高于治疗对照组，且GIK+SP组高于GIK组和SP组(P<0.01)。见表5。

表3 4组严重烫伤多器官功能不全综合征大鼠血LA、PA和LA/PA水平变化

注：GIK组为极化液治疗组，SP组为丙酮酸钠治疗组，GIK+SP组为极化液和丙酮酸钠联合治疗组，对照组仅给予生理盐水；LA为乳酸，PA为丙酮酸；与伤前比较，bP<0.01；与对照组比较，dP<0.01；与GIK组比较，fP<0.01；与SP组比较，hP<0.01

表4 4组严重烫伤多器官功能不全综合征大鼠血浆sTREM-1和HMGB1水平变化

注：GIK组为极化液治疗组，SP组为丙酮酸钠治疗组，GIK+SP组为极化液和丙酮酸钠联合治疗组；sTREM-1为血可溶性髓样细胞触发蛋白1，HMGB-l为高迁移率族蛋白B1;与伤前比较，bP<0.01；与对照组比较，dP<0.01；与GIK组比较，fP<0.01；与SP组比较，hP<0.01

表5 4组严重烫伤多器官功能不全综合征大鼠血浆MDA和SOD水平变化

注：GIK组为极化液治疗组，SP组为丙酮酸钠治疗组，GIK+SP组为极化液和丙酮酸钠联合治疗组，对照组仅给予生理盐水；MDA为丙二醛，SOD为超氧化物歧化酶;与伤前比较，bP<0.01；与对照组比较，dP<0.01；与GIK组比较，fP<0.01；与SP组比较，hP<0.01

3 讨论

极化液基本成分为葡萄糖、胰岛素和氯化钾，不同成分发挥不同作用，葡萄糖为机体提供营养和能量，胰岛素刺激葡萄糖转运体(GLUT)的细胞内移位和活性，调节葡萄糖代谢关键酶活力，促进葡萄糖的有效转运和代谢利用。葡萄糖和胰岛素都能刺激细胞膜上钠-钾泵(Na+-K+-ATPase)活性，在促进葡萄糖转运同时也增进钾离子由细胞外泵向细胞内，降低血钾浓度，因此，输注葡萄糖同时输注氯化钾可避免输注葡萄糖引起的低钾血症[11-12]。

文献报道，胰岛素不仅用于控制糖尿病患者高血糖，还可用于外科手术后及严重感染炎症危重病患者高血糖控制，抗氧化与抗炎症效果良好[13-18]。严重创伤患者血糖水平不一定升高，极化液不仅用于严重创伤高血糖患者，也可用于严重创伤正常血糖患者，其作为葡萄糖和胰岛素联合制剂较单纯胰岛素治疗更具有广泛的适应证。极化液在创伤患者应用过程中，应密切观察血钾和血糖水平，及时调整葡萄糖和氯化钾用量[9]。

严重创伤后并发高血糖、高乳酸血症及LA/PA比值升高，加剧MODS发生与发展，高乳酸血症可作为评估严重创伤、败血症和休克等危重病预后的重要指标[19-20]。本研究结果表明，极化液治疗可降低严重创伤内毒素血症MODS大鼠空腹GLU、LA和LA/PA比值等糖代谢障碍指标和氧化还原势能减低的相关指标，提示极化液治疗不仅能改善糖代谢障碍还能够控制高乳酸血症。血sTREM-1是细胞膜TREM-1游离的可溶性片段，可作为创伤患者早期感染标记物，膜TREM-1属于内毒素信号转导相关受体蛋白，内毒素与膜TREM-1启动机体炎症级联反应，诱发机体肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等多种炎性细胞因子升高。HMGB-1是一种晚期升高敏感的感染炎性细胞因子，严重创伤感染者血HMGB-1升高[21-22]。本研究结果显示，极化液治疗可降低严重创伤内毒素血症MODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平，提示极化液有良好抗炎作用。血MDA升高伴随SOD活力下降是评估机体氧化应激程度的重要实验室指标[23]。本研究结果显示，极化液可降低严重烧伤MODS大鼠血MDA水平，提高SOD活力，提示极化液也有抗氧化作用。极化液抗氧化机制可能与胰岛素直接抗炎和降低高血糖及纠正糖代谢障碍和改善机体营养有关。

PA是体内天然小分子物质，是葡萄糖代谢中间产物，也是葡萄糖代谢生成大量ATP三羧酸循环原料乙酰辅酶A的前提物质，内源性PA参与全身各组织和器官细胞三大物质能量代谢。丙酮酸钠易溶于水，在体内通过结合氧和氮自由基，直接发挥强有力的抗氧化作用，也可通过提高细胞内氧化还原势能，间接发挥抗氧化功能[24-25]。近年文献报道，丙酮酸盐无论经静脉、腹腔或口服途径，在致死性休克复苏中能提高细胞的缺氧耐受性，都有显著的多器官保护和纠正糖代谢紊乱的作用，并有效逆转缺氧型乳酸性酸中毒，成倍提高实验动物生存率[26-27]。

本研究结果显示，丙酮酸钠治疗可明显降低严重烧伤MODS大鼠血LA和LA/PA比值等指标，提示丙酮酸钠具有控制高乳酸血症的功能。本研究结果还表明，丙酮酸钠和GIK治疗均明显提高血PA浓度，说明丙酮酸钠降低LA/PA比值主要与降低LA水平和提高PA水平有关。本研究结果显示，丙酮酸钠治疗可显著降低严重烧伤MODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平,也可以显著降低MDA水平和提高血SOD活力，进一步说明丙酮酸钠和极化液一样具有有力的拮抗严重创伤MODS过度炎性反应和氧化应激效果。丙酮酸钠和极化液也具有类似的抑制高乳酸血症作用,但因未观察酸中毒指标，丙酮酸钠是否对纠正危重的乳酸性酸中毒，或合并治疗有更好的效果,尚有待观察。需要指出的是本文所用丙酮酸钠治疗剂量为12.5 mg/(kg·d),属于超小剂量治疗，尽管结果显示其具有控制高乳酸血症和有力的抗氧化与抗炎作用，但不能完全纠正高乳酸血症和逆转LA/PA比值，可能与使用剂量小有关。丙酮酸钠不同治疗剂量疗效评估值得进一步研究。

虽然丙酮酸乙酯也具有抗炎和抗氧化作用[24]，但丙酮酸钠和丙酮酸乙酯有本质不同， 丙酮酸钠是盐类，在体内天然存在，而丙酮酸乙酯是酯类，并不存在于体内。尽管二者都能纠正高乳酸血症，并具备抗氧化和抗炎作用，但丙酮酸乙酯并不同时具备纠正代谢性酸中毒的作用，水溶液并不稳定,二期临床试验已经失败[28]。丙酮酸钠的实验和临床研究国内外已有多项报道，其大剂量输注显示安全无毒性[29]。纠正高乳酸血症、控制炎症和氧化应激是治疗危重病患者的重要措施，临床需求迫切性值得深入探讨丙酮酸盐的潜在作用，丙酮酸钠相对丙酮酸乙酯更具有临床应用和新药开发前景。

综上所述，严重创伤MODS患者往往需要综合治疗，极化液和丙酮酸钠均作为人体内天然存在的成分，二者联合治疗效果值得研究。胰岛素、葡萄糖和丙酮酸钠在纠正高乳酸血症、抗炎和抗氧化方面，可能存在协同促进作用，胰岛素不仅促进葡萄糖生成丙酮酸，并进一步促进丙酮酸代谢和三羧酸循环生成大量ATP，深入的作用机制值得进一步探讨。