10个DNA分子标记在小麦抗条锈病辅助育种上的应用

张成兵， 刘青利， 张先平， 李 云， 邢丽红， 张 羽

(1.陕西省汉中市农业科学研究所，陕西汉中 723000； 2.陕西省渭南市临渭区种子管理站，陕西渭南 714000；3.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中 723000)

条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麦叶部病害，是世界上小麦的主要真菌病害，也是我国小麦生产中重要的病害之一，在我国曾多次大流行[1]。防治小麦条锈病主要通过使用化学农药和种植抗性品种2种途径，化学防治通常成本高、污染环境且残留的成分危害人类健康。因此，发掘新的优良抗条锈病基因及其紧密连锁的分子标记，培育持久高抗病品种具有经济、有效、环保等重要意义。随着DNA分子标记技术的发展，相继开发了一些与条锈病抗性基因紧密连锁的分子标记，利用已知抗条锈病基因的分子标记，可以从DNA水平上对育种材料进行快速、准确的检测和评价，进而明确小麦品种中抗性基因的分布，为高效开展条锈病抗性基因聚合育种带来了新的契机。Chen等筛选到了与抗性基因Yr5紧密连锁的随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphism DNA，简称RAPD)和简单序列重复(simple sequence repeat，简称SSR)标记[2]。Weng等筛选到了与Yr9紧密连锁的SSR标记Xgwm582(3.7 cM)和Xgwm264(37.9 cM)[3]。邵映田等在Yr10的供体亲本Moro中筛选到与Yr10紧密连锁的扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism，简称AFLP)标记[4]。Peng等研究了与抗条锈病基因YrH52、Yr15连锁的分子标记[5]。刘亚萍在小麦1BS上筛选到Yr24的SSR标记Xgwm11(6.1 cM)和Xgwm273(7.1 cM)[6]。严俊等在抗病材料H52中筛选到抗性连锁的抗性基因类似物(resistance gene analogue，简称RGA)分子标记[7]。殷贵鸿等从小麦抗条锈病骨干亲本周8425B中筛选得到与抗性基因紧密连锁的片段长度为343 bp的抗病基因类似序列多态性分子标记技术(resistance gene analogue polymorphism,简称RGAP)标记Xrga-1[8]。李嘉从济麦22/Avocet S和济965261中分别找到了抗条锈病基因的连锁SSR标记Xwmc658、Xgwm582[9]。朱晓娜等筛选到抗条中32号小种(CYR32)的特异RAPD标记S20[10]。目前，已有57个抗条锈病基因被正式命名，编号从Yr1到Yr54(其中有等位基因)，以第1个抗条锈病基因Yr10为代表的数个基因被克隆。但生产中由于大面积种植单一小麦品种，致使条锈菌在定向的选择压力下迅速变异，并引起优势小种种群的增长和小麦条锈菌新小种的产生，进而导致一个抗锈品种在生产上能大面积应用的时间较短，随着其原有抗锈性的丧失而失去应用价值，特别是新的条锈菌生理小种条中32(CYR32)和条中33(CYR33)的出现和蔓延，导致多数主栽品种失去抗性。目前，对CYR32和CYR33表现抗性的主效基因仅剩Yr5、Yr15、Yr24、Yr26(与Yr24等位)、YrH52、YrZH84等。李在峰用26个国内外条锈菌生理小种对98个我国小麦品种(系)进行苗期基因推导，发现携带Yr9基因的材料占43%，其次为Yr26基因[11]。伍玲等检测了2004、2005年四川省小麦区域试验72份材料中抗条锈基因Yr5、Yr10、Yr15的分布情况，携带Yr15基因的材料最多，占11.11%，其次为Yr5基因，占5.56%，再次为Yr10基因，占 1.34%[12]。李峰奇等对126份我国黄淮麦区重要的小麦品种(系)进行抗条锈病基因分子检测，发现携带Yr9基因的小麦品种频率最高，为41.6%，其次是Yr5、Yr10、Yr15、Yr26基因[13]。张胜利等用不同材料检测抗性基因Yr5-156、Yr9-2、Yr24-1在不同材料中的分布情况，发现在感性材料中也能扩增出和抗病材料同样的特异性目标条带[14-16]。王欣等对青海省育成和引进的137份小麦品种进行Yr10、Yr15基因的特定序列扩增区域(sequence characterized amplified regions，简称SCAR)标记和SSR标记以及1BL/1RS易位的复合标记进行了检测，结果显示1BL/1RS易位占参试材料的16.1%，其次为Yr15基因，占13.9%，再次为Yr10基因，占2.9%[17]。薛文波等对74个主栽小麦品种进行了连续2年的成株期抗病性鉴定结合抗性基因检测，携带Yr9基因的占32.43%，携带Yr26基因的占6.76%，携带Yr17基因的占5.41%，74个供试材料中未检测到Yr5、Yr10、Yr15、Yr18基因[18]。张玉薇等利用Yr10、Yr18基因以及1BL/1RS易位的SCAR或STS标记在75份2006—2010年国家审定的小麦品种中的分子检测显示，携带Yr10基因的占17.33%，携带Yr18基因的占1.33%，1份材料中同时检测到Yr10+Yr18基因组合，25份材料中含有 1BL/1RS 易位片段[19]。李敏州等对115份陕西省主栽和后备小麦品种(系)进行抗性基因检测，结果显示携带Yr9基因的占35.65%，携带Yr5基因的占2.61%，携带Yr18基因的占 2.61%，携带Yr26基因的占1.74%，115份材料中均不含Yr10基因[20]。徐琪等构建了检测Yr1、Yr2基因的分子标记gwm372和gwm382，并用此检测来自我国各麦区的181份小麦高代系材料，结果显示Yr1、Yr2基因在181份小麦高代系材料中占比较低[21]。陈天青等调查了140份2013—2014年西南地区主要的小麦种质资源中几个抗锈病基因的分布情况，显示携带Yr26基因的占41.4%，其次为Yr9基因，占37.9%，Yr10、Yr15、Yr18基因占比较低，Yr9+Yr26基因组合出现的频率较高[22]。孙建鲁等对100个小麦品种资源抗条锈病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26的检测结果显示，携带Yr18基因的占19.00%，携带Yr10基因的占4.00%，携带Yr15基因的占2.00%，携带Yr5基因的占1.00%，供试材料中均不含Yr24、Yr26基因[23]。李北等对重庆地区的18份当地主栽品种和89份高代品系材料进行了7个已知抗条锈基因的分子检测，供试材料中携带Yr26基因的最多，占 36.45%，其次为Yr9基因，占19.63%，携带Yr17基因的占15.89%，携带Yr18基因的占2.80%，没有检测到含Yr5、Yr10、Yr15基因的材料[24]。黄亮等对我国小麦主产区的79个小麦品种(系)进行抗条锈病基因检测，结果表明供试小麦品种中1B/1R易位的占44.3%，携带Yr10基因的占10.1%，携带Yr5基因的占5.1%，携带Yr18基因的占3.8%，携带Yr26基因的占1.3%[25]。白微微等检测46份新疆麦区小麦材料中Yr10基因及1BL/1RS易位的分子标记，发现 1BL/1RS 易位的占19.57%，携带Yr10基因的占2.20%[26]。我国小麦品种中抗条锈基因过于单一，在我国条锈病流行区主栽品种中，有效抗源主要集中在92R系列(携带Yr26)、贵农系以及少数携带Yr24的国际玉米小麦改良中心(centro internacional de mejoramientode maizy trigo，简称CIMMYT)抗源种质[27]。

本研究以陕西省汉中地区大面积种植品种汉麦5号(汉5)和汉麦6号(汉6)为母本，以抗源品种贵农22中选出的一个品系为父本进行杂交，以多代定向选择选育出的高代品系为供试材料，通过检测与Yr5、Yr9、Yr15等基因连锁的分子标记在供试材料中的分布情况，以期为新品种(系)的抗性遗传基础鉴定及持久抗性材料选育提供技术支撑。同时，选取与Yr9基因遗传距离不同的2个连锁分子标记进行检测，以验证分子标记与目标基因之间是否发生交换。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料45份，其中陕西省汉中地区大面积种植品种6份(汉5、汉6、D002、川麦42、9503、川麦107)，汉5与贵农22杂交后选育的高代品系4份(汉5-1、汉5-2、汉5-3、汉 5-4)，汉6与贵农22杂交后选育的高代品系32份(汉6-1至汉6-32)，育种材料2份[贵农22-1、贵农22(病圃)]，抗锈性鉴定诱发品种1份(铭贤169)，所有材料均由陕西省汉中市农业科学研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取及PCR 小麦基因组DNA采用十二烷基苯磺酸钠(SDS)法提取，并采用0.8%琼脂糖凝胶检测基因组DNA的质量。PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，反应总体积为30 μL，用ddH2O补足。反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性50 s，x℃(此温度根据引物而定)退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，用银染法显色拍照。

1.2.2 引物信息 抗性基因的引物信息如表1所示，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 结果与分析

Yr5基因的特异引物Yr5-156扩增的目标带大小在 156 bp 左右[2]。由图1可知，以100 bp DNA Marker为对照，携带Yr5基因的材料在156 bp左右均能扩增出特征性条带，反之则没有条带。

表1 引物信息

注：“？”代表遗传距离不清楚。

由表2可知，在45份供试小麦材料中，42份材料检测出Yr9-2基因，占93.33%；38份材料检测出Yr5基因，占 84.44%；13份检测出Yr10基因，占28.89%；16份检测出YrH52基因，占35.56%；21份检测出YrZH84基因，占 46.67%；17份材料检测出Yr24基因，占37.78%；36份材料检测出Yr9-1基因，占80.00%；26份材料检测出YrJ22基因，占57.78%；18份材料检测出S20标记，占40.00%。供试材料中，携带最多的为Yr9-2基因，其次为Yr5基因，所有材料中均不含Yr15基因。

由表3可知，与抗小麦条锈病有关的10个DNA分子标记检测中，其中同时在1个材料中检测到4个抗性DNA标记的最多，占22.22%；含有9个标记位点的材料只有汉6-31，占供试材料的2.2%；含有8个标记位点的材料有5份，分别为汉6、汉5-1、汉6-16、汉6-24、汉6-25，占供试材料的 11.1%。可见这些材料除不含对CYR32、CYR33表现抗性的主效基因Yr15外，其他基因如Yr5、Yr24、Yr26、YrH52、YrZH84等均存在，这些材料可以在育种及生产中广泛推广应用，尤其是汉6-31，可以加大该主栽品种的推广力度。

3 讨论与结论

本研究采用与小麦抗条锈病基因连锁的10个分子标记对45份陕西省汉中地区主要小麦种质资源进行检测，铭贤169在小麦抗条锈病基因的图位克隆定位中常被用来作为感病品种，本研究检测的10个分子标记在铭贤169中均没有检测到，可以看出试验结果可信度较高。张胜利等用Yr5、Yr9基因抗性标记对小麦条锈病表现不同的抗感材料检测时，在感性材料中发现也能扩增出和抗病材料同样的特异性目标条带，一方面暗示了抗病表型与基因关系的复杂性，不是简单的一对一关系，另一方面可能由于标记与基因之间没有达到完全的共分离程度，导致标记与目的基因之间发生了交换[14-15]。本研究利用与Yr9基因连锁(Xgwm264-Xgwm582-Yr9)的遗传距离不同的2个标记(Xgwm582、Xgwm264)同时检测，从结果可以看出，用来检测Yr9基因的2个分子标记结果有所差异，有的材料可能在Xgwm264与Yr9基因之间发生了交换。如果以与Yr9基因紧密连锁的SSR标记Xgwm582为依据，在45份供试小麦材料中，Yr5基因的检出率最高，其次为Yr9-1(Xgwm582)基因，说明携带Yr5、Yr9基因的材料是目前陕西省汉中地区小麦种质资源中的有效抗源，这与Yr9基因曾广泛应用于小麦抗条锈病育种有关。来源于野生二粒小麦的抗性基因Yr15、YrH52虽然都被定位在染色体1BS上，但本研究检测Yr15、YrH52基因的不一致结果也与Peng等推测其为2个不同的基因[5]一致。贵农22是陕西省汉中市农业科学研究所在全国小麦品种抗病性变异观察圃(汉中点)中选出的一个抗源材料，韩德俊等也曾报道，在目前我国条锈病流行区主栽品种中，有效抗源主要集中在92R系列(携带Yr26基因)、贵农系和少数携带Yr24基因的CIMMYT抗源种质[27]。贵农22作为抗源材料之一， 与汉中麦区的主栽品种杂交，选育抗条锈病的小麦新品种与新材料具有很好的实践意义，本研究的结果也印证了这一点，在选育的高代品系中含有8个及以上分子标记位点的材料有6份，这为以后的选育工作奠定了基础。

表2 抗条锈病基因在供试材料中的分布情况

注：“+”代表检测到特定条带，“-”代表未检测到特定条带。

表3 供试材料携带的抗性标记位点数目

在小麦抗条锈病的分子标记开发中，很多标记是基于特定材料而构建的，其变异位点不一定适合对所有小麦资源进行抗感检测，在其功能标记未探明前，往往与目标基因有多个连锁标记，在分子标记辅助育种进行选择时应选择遗传距离最小的标记，同时应尽量把分子标记检测与田间抗病性鉴定结合起来共同筛选抗性资源。另外，由于新的抗条锈病生理小种的出现，在小麦抗条锈病育种中应不断发掘、扩增新的小麦条锈病抗源，以培育新的优势抗病品种。