96份桑树地方品种农艺性状的关联分析

张 林， 高 敏， 倪红梅， 方荣俊， 潘 刚， 赵卫国， 刘 利

(1.江苏科技大学生物技术学院，江苏镇江 212018； 2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江 212018)

桑树(MorusalbaL.)为桑科(Moraceae)桑属(MorusL.)落叶乔木或灌木，原产中国中部和北部，叶为桑蚕饲料，桑树品种、桑叶产量及叶质是养蚕的决定性因素。因此作为蚕业生产基础资料的桑树品种，其经济性状的改良对促进蚕业发展有着巨大的作用。不断提高桑树品种的产量、品质、抗病性和适应性是现代桑树育种家追求的主要目标[1]。但是桑树的多数经济性状与农艺性状，例如产量、品质、抗逆性、抗病性等都是数量性状。与质量性状的遗传特性不同，数量性状受多基因的数量性状位点控制，遗传基础比较复杂，而且容易被环境因素影响，且呈连续性变异，表现型与基因型的对应关系也不明确，对其遗传基础的研究比较困难[2]，了解和研究这些数量性状的遗传规律对农作物的遗传改良具有重要意义。

本研究拟采用以PCR技术为基础的ISSR技术探讨供试材料的遗传多样性。ISSR技术具有遗传多态性高、重复性好、使用范围广、操作简单、试验成本低等优点，ISSR技术因其简便快速、稳定可靠的特性已在一些农作物和经济作物的遗传性研究上获得了广泛的应用并取得了理想的结果，该技术在研究桑树种质资源的品种鉴定和亲缘关系分析、群体遗传结构和遗传多样性研究方面也是一种行之有效的工具。Prevost等采用4个ISSR引物对34个马铃薯品种进行分析研究，并将这34个品种区别开来[3]。Vijayan等用17个ISSR引物对印度桑属野生品种进行了遗传多样性分析[4]。

关联分析是建立在连锁不平衡的基础上，能够识别群体内目标性状与候选基因或遗传标记之间的关系，从而鉴定群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法[5]。该方法近期开始在植物数量性状研究和植物育种中应用，其利用的是自然变异，不需要花费过多的时间和精力去构建作图群体，可以广泛地检测遗传变异，具有较高的分辨率[1]。本研究拟对我国桑树地方品种及创新桑种质的性状进行关联分析，从而寻找与其表型相关的优异基因，从分子水平解释桑树表型性状的遗传变异规律，进而为桑树数量性状遗传改良研究提供理论基础，为桑树杂交育种寻求新途径。Thornsberry首次将关联分析引入到植物复杂性状研究中，发现了与玉米花期性状呈显著性相关的Dwarf8基因序列的多态性[6]，被广泛应用于拟南芥[7]、水稻[8]和大豆[9]等作物中。总之，关联分析将成为研究植物数量性状的强有力工具，为更深刻地认识和了解植物数量性状的遗传规律及品种的遗传改良提供了新的方法和途径。本研究利用ISSR分子标记技术，对黄河流域鲁桑、太湖流域湖桑2种类型共96份桑树品种的21个农艺性状进行调查研究，并利用10个ISSR标记的多态性对供试材料进行遗传多样性和群体结构分析，从而分析遗传标记与表型性状的相关性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为取自中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江国家桑树种质资源圃的96份桑树种质，其中包括34份黄河下游鲁桑桑树种质和62份太湖流域湖桑桑树种质，供试的96份桑树试验材料的来源见表1。

1.2 桑树种质资源农艺性状的鉴定

在国家种质江苏镇江桑树圃对桑树种质农艺性状进行田间调查，依据《桑树种质资源描述规范和数据标准》[10]的要求确定取样方法和调查标准，参照本课题组桑树农艺性状的数据库，计算出每份桑树种质资源的所有农艺性状的平均值、变异系数和标准差，并进行方差检验分析，判断试验结果的可靠性和稳定性。取平均值作为该种质的最终性状值，最后统计并分析各个性状的平均值。

表1 桑树种质资源材料的来源

续表1

编号品种来源桑种55甩桑2号浙江省新昌县湖桑56胡桃桑浙江省肖山县湖桑57弯条桑浙江省湖州市湖桑58湖桑3号江苏省无锡市湖桑59湖桑5号浙江省杭州市湖桑60湖桑6号浙江省杭州市湖桑61湖桑10号江苏省无锡市湖桑62湖桑20号江苏省无锡市湖桑63湖桑21号江苏省无锡市湖桑64湖桑24号江苏省无锡市湖桑65湖桑26号江苏省无锡市湖桑66湖桑31号江苏省无锡市湖桑67溧阳红皮江苏省南京市湖桑68新桥青桑浙江省富阳市湖桑69湖桑36号江苏省无锡市湖桑70湖桑37号江苏省无锡市湖桑71湖桑38号江苏省无锡市湖桑72湖桑39号江苏省无锡市湖桑73湖实鸡冠江苏省无锡市湖桑74梅村1号江苏省无锡市湖桑75湖桑60号江苏省无锡市湖桑76无锡短节湖江苏省无锡市湖桑77湖桑86号浙江省杭州市湖桑78镇荷桑浙江省湖州市湖桑79洞庭1号江苏省苏州市湖桑80富阳青浙江省富阳市湖桑81富阳桑浙江省富阳市湖桑82石门青浙江省桐乡市湖桑83早青桑浙江省德清县湖桑84璜桑3号浙江省诸暨市湖桑85璜桑14号浙江省诸暨市湖桑86海盐面青浙江省海盐县湖桑87大种桑浙江省富阳市湖桑88海桑浙江省鄞县 湖桑89白色青浙江省海宁市湖桑90望海桑浙江省嵊县 湖桑91菱湖大种浙江省湖州市湖桑92璜桑8号浙江省诸暨市湖桑93白皮大种浙江省湖州市湖桑94猪肚桑浙江省嵊县 湖桑95吴兴大种浙江省湖州市湖桑96剪刀桑浙江省嵊县 湖桑

1.3 ISSR引物的选取与扩增

选取加拿大哥伦比亚大学的设计并参考赵卫国博士论文中部分引物[11]进行多态性筛选，初步选定了22个引物用于ISSR分子标记，引物由上海生物工程技术有限公司合成。桑树总DNA的提取拟采用植物基因组提取试剂盒法，PCR程序为94 ℃ 7 min；94 ℃ 40 s，退火45s(根据Tm值而定)，72 ℃ 90 s，36个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。ISSR-PCR电泳并照相记录后，进行人工读带。同一引物的扩增产物中，分子量大小及强度相近的条带被认为具同源性，属于同一位点的产物。读带时要遵循排除模糊不清的条带、只记录清晰且易于辨认的条带的原则。对于分子量大小相同但强度不同的条带，当强带的强度大于弱带的2倍时，则将它们读为不同的条带。

1.4 群体结构分析

利用Structure 2.3.4软件对供试材料进行基于贝叶斯数学模型的聚类分析，从而估算其群体结构关系。计算材料相应的遗传成分系数(Q)：当某材料在某个类群中的Q值≥0.5时，该品种将被划分到相应的类群中，认为该品种的血缘相对比较单一；若某材料在任何类群中的Q值均 <0.5 时，则认为该品种拥有混合来源[12-15]。按照以上方法将群体中各材料划分至对应的亚群并绘制群体结构图。

1.5 亲缘关系系数分析

亲缘关系系数(Kinship)是衡量品种间亲缘相似性的参数，本研究采用SPAGeDi软件计算96份桑树种质个体间的亲缘关系，得到亲缘关系系数矩阵(K矩阵)。亲缘关系是2个材料个体间的遗传相似度与任意材料个体间遗传相似度的相对值，因此当Kinship值<0时，表明某2个材料品种间的亲缘关系低于群体中任意2个材料品种的亲缘关系，则直接定义此值为0，所有系数加倍[16-17]。

1.6 标记和农艺性状的关联分析

结合TASSEL 2.1软件中的MLM模型[17]，分析性状与标记位点之间的关联性，并计算标记位点对表型变异的贡献率(即解释率)。综合96份桑树材料各农艺性状的表型数据和标记位点的多态性数据，以群体结构的Q值作为协变量，将96份供试材料的亲缘关系K矩阵连同21个农艺性状表型数据，对93个多态性标记位点进行标记和性状间的关联分析[17]。所得结果中当P<0.01时，则认为该标记与相应性状之间存在极显著的关联性。

2 结果与分析

2.1 桑树地方品种的主要农艺性状

从表2可见，这21个农艺性状变异幅度存在较大差异，其中变异系数在30%以上的性状为生长芽率、春米条叶、秋公斤数、梢梗叶、椹梗叶、叶梗叶和株产叶量，梢梗叶、椹梗叶和叶梗叶的变异系数甚至达到了50%以上。椹梗叶的变异系数最大，为 180.99%，秋万头茧量的变异系数最小，为9.32%。结果表明，供试桑树种质资源品种间的各性状存在较大差异，多样性比较丰富，可为桑树育种提供丰富的亲本材料。

表2 96份供试材料21个农艺性状的基本描述性统计

2.2 遗传多样性统计分析与聚类分析

通过筛选，从22个引物中选出的多态性强、条带清晰、结果稳定且重复性好的10个引物被用于桑树地方品种的ISSR分子标记多态性分析。10个ISSR引物通过PCR反应共扩增出93条清晰的带，其中73条带具有多态性，多态性条带百分率为78.49%，平均每个引物扩增的条带数为9.3条，平均每个引物扩增的多态性条带数为7.3条。不同引物的扩增带数从7到11不等。平均每个位点观测等位基因数为1.795 7，有效等位基因数为1.496 4，Nei’s遗传多样性指数为 0.286 9，Shannon’s信息指数为0.426 8，表明96份供试材料之间的ISSR变异大，多态性高。

2.3 品种聚类分析

利用73个多态性位点数据，96个品种被聚为2类(图1)，Ⅰ类34份材料均为鲁桑品种，来自山东省的7个品种亲缘关系较近，被聚为一类，Ⅱ类为62份湖桑品种，湖桑和鲁桑亲缘关系较远。

2.4 群体结构分析

通过采用基于贝叶斯的聚类分析方法分析供试材料的遗传结构，从而确定其群体数目。利用Structure 2.3.4软件评估群体的K值，即亚群数(范围设为2～10)，依据运算的输出结果，K与ΔK的关系如图2所示。当K=2时，模型中的ΔK出现峰值。因此根据分析结果可将参试的96份桑树种质划分为2个亚群，群体结构聚类结果见图3。各个品种在不同亚群中的Q值如表3所示，当Q<0.5时，亚群1含有的34份桑树材料全部为黄河下游鲁桑桑树种质，亚群2的62份供试材料为太湖流域湖桑桑树种质。96份样本的划分与UPGMA聚类分析的结果完全一致，这也体现了Structure软件对群体结构进行聚类分析的准确性。

2.5 群体亲缘关系分析

结合93个ISSR标记位点，利用SPAGeDi软件对96份供试材料进行亲缘关系分析，品种间的平均亲缘关系Kinship值为0.111 3，其中52.11%的材料间的Kinship值为0，约39.63%的材料Kinship值在0～0.2之间，Kinship值小于0.5的情况达到了总数的96.18%，亲缘关系在0.5以上的情况只占到了3.82%(图4)。这说明96份地方桑树品种间的亲缘关系较弱，极少数的品种之间有较近的亲缘关系，表明参试品种之间存在着丰富的遗传变异和广泛的代表性。

表3 96份桑树材料在2个亚群中的Q值

2.6 标记与农艺性状的关联分析

通过TASSEL 2.1软件的MLM模型，把Structure软件计算出的群体结构数据(Q值)作为协变量，将96份供试材料的亲缘关系K矩阵连同叶长、叶幅、节间距等农艺性状表型数据对93个多态性标记位点进行标记和性状间的关联分析。标记位点对表型性状的解释率见表4。从表4可以看出，经MLM混合线性模型检测的93个位点中，与15个表型农艺性状(叶长、节间长、生长芽率、春米条叶、秋米条叶、春公斤数、秋公斤数、叶梗叶、梢梗叶、条梗叶、株产叶量、春万头茧量、春万茧层量、春担桑茧量、秋万头茧量)相关的标记位点共有28个，变异解释率为5.42%～16.35%。其中与叶长相关的位点有2个，表型变异的解释率为11.58%和8.62%，解释率最大的标记为loci5。与节间长、生长芽率和秋万头茧量相关联的位点各有3个，表型变异解释率最大的标记分别位于loci86(解释率为10.87%)、loci72(解释率为8.62%)和loci45(解释率为10.20%)。与春米条叶、春万头茧量、春担桑茧量相关联的位点各有5个，各自的表型变异解释率分别在7.73%～10.69%、6.41%～13.73%、6.00%～11.97%之间，解释率最大的标记分别为loci66、loci21和loci45。有2个标记位点与秋米条叶相关联，位点loci66的表型变异解释率最大，为15.40%。春公斤数、条梗叶和株产叶量都有4个标记位点与之相关联，其中春公斤数的最大表型变异解释率为loci70(解释率为16.35%)，条梗叶和株产叶量都与loci64位点相关联且二者的最大表型变异解释率的标记也为loci64。秋公斤数只有变异解释率为9.17%的loci81位点与之相关联，叶梗叶与6个标记位点相关联，最大变异解释率为9.78%，位于loci59位点。与梢梗叶和春万茧层量相关联的标记位点各有7个，最大变异解释率分别为13.92%和15.25%，位于位点loci90和位点loci21处。叶幅、发芽率等6个农艺性状未检测出与其相关联的标记位点。在28个标记位点中有1个标记位点同时与5个农艺性状相关联，有4个位点同时与4个农艺性状相关联，有4个标记位点同时与3个农艺性状相关联，有10个位点同时与2个农艺性状相关联。

表4 与农艺性状极显著关联(P<0.01)的标记位点及其对表型变异的解释率

3 结论与讨论

3.1 遗传多样性与群体结构分析

本研究通过利用ISSR分子标记对96份桑树种质资源进行遗传多样性和群体结构分析，结果表明96份供试材料个体间存在着丰富的遗传多样性，同时基于遗传系数的UPGMA聚类分析结果也显示出了参试品种的遗传多样性。

在进行关联分析时，一些本不关联的等位基因会与一些目标性状之间存在着连锁不平衡(linkae disequilibrium，LD)现象，即所谓的伪关联或假 阳性现象。因此在进行关联分析时必须评估群体结构，了解群体内供试材料的遗传学相关信息，这样才能尽量减少假阳性现象的出现，以保证关联分析准确有效地进行。利用Structure软件对供试材料进行基于贝叶斯数学模型的群体结构聚类分析，结果显示96份样本的划分与UPGMA聚类分析的结果完全一致，更准确地反映出了供试材料间的群体结构。

3.2 表型农艺性状与分子标记的关联分析

关联分析作为一种数量性状分析方法，已在植物研究领域得到广泛应用。为减少关联分析过程中存在的假阳性现象，本研究采用MLM模型对96份供试材料进行混合线性分析，该模型能有效检测出多态性标记位点与性状之间的关联性，使关联分析的结果更精确。分析结果显示参试的10个ISSR标记共93个多态性位点中，在P<0.01的极显著情况下，与叶长、节间距等15个农艺性状相关的标记位点共有28个，变异解释率为5.42%～16.35%，其中有1个标记位点同时与5个农艺性状相关联，有4个位点同时与4个农艺性状相关联，有4个标记位点同时与3个农艺性状相关联，有10个位点同时与2个农艺性状相关联，未检测出与叶幅、发芽率等6个农艺性状相关联的标记位点。