柱前衍生化HPLC法测定玉屏风复合多糖的单糖组成

王少杰， 巴 娟， 张勇军， 邓 桦， 蒲文珺， 杨 鸿

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院， 广东 佛山 528231)

中药多糖具有增强免疫力、抗应激、抗病毒等广泛的生物学活性，已在畜牧兽医领域得到广泛的应用，也是新兽药研究的热点。玉屏风散出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，是中医扶正固本的代表方剂，由黄芪、白术、防风三味药物组成，YPF-P为玉屏风散的有效部位群，研究表明,玉屏风散及其多糖对免疫系统有广泛的调节作用[1-3]，在兽医临床有较好的应用前景。

目前兽用中药多糖的质量控制标准不完善，往往仅检测总糖含量，致使一些假、劣的多糖产品屡屡出现。多糖所具有的药理活性及其单糖组成是密切相关的，因此在检测总糖含量时还需对其单糖组成进行定性分析[4-7]。由于多糖和单糖都不具有紫外吸收，无法直接对其进行测定[8]，因此本试验先对YPF-P进行水解和衍生化处理，再采用高效液相色谱法(HPLC)分析其单糖组成及其物质量比，为YPF-P质控标准的制定进行探索性研究，也为兽用中药多糖的质量控制研究提供借鉴。

1 材料

1.1 药品 中药黄芪、白术、防风，购自北京同仁堂药店佛山分店；D-甘露糖(批号：140651-201403)、鼠李糖(批号：111683-201502)、D-核糖(批号：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批号：111646-200301)、阿拉伯糖(批号：1506-200001)。对照品购自中国食品药品检定研究院；D-葡萄糖(批号：201705)，D-半乳糖(批号：201705)对照品，购自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 试剂 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、无水乙醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸(TFA)、硫酸、盐酸、氢氧化钠均为分析纯；乙腈、甲醇均为色谱纯。

1.3 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪；雷磁PHS-3C pH计；LABCONCO FreeZone®真空冷冻干燥机；湘仪H1650-W台式高速离心机；UV-6000型紫外/可见分光光度计；HH-8恒温水浴锅；予华RE-201D旋转蒸发仪。

2 方法

2.1 YPF-P的制备及含量测定[9]将黄芪、白术、防风按3∶1∶1的质量配方。采用L9(34)正交试验设计优化水提醇沉淀的提取工艺，将提取的粗多糖经AB-8大孔树脂纯化浓缩，真空冷冻干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

2.2 YPF-P水解 称取50 mg精制多糖两份，置于两个10 mL密封试管中加入2 mol/L的TFA溶液2 mL,97 ℃水浴8 h，水解结束放凉后用4 mol/L NaOH溶液中和至中性，离心取上清即得。

2.3 混合单糖标准品与YPF-P水解样品的衍生化 分别称取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、阿拉伯糖对照品各5 mg，定容于25 mL容量瓶中即得混合单糖标准品。取该溶液100 μL与0.5 mol/L PMP 甲醇溶液50 μL及0.3 mol/L NaOH 溶液50 μL混合，充分振摇，水浴条件下反应30 min。冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl 50 μL进行中和，加入1 mL 氯仿萃取，离心，弃去有机层，重复萃取3 次，得上层水液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，备用[10]。取精制YPF-P水解样品100 μL采用同样的方法进行衍生化处理即得。

2.4 色谱条件与专属性试验 色谱柱：Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相：磷酸盐缓冲溶液(pH值6.9)-乙腈(85∶15)；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL，检测波长254 nm。分别取对照品溶液和供试品溶液进样测定，各色谱峰得到良好的分离。

2.5 方法学考察 精密度试验：取混合单糖标准品溶液，衍生化后连续进样6次，以峰面积的RSD值考察仪器精密度；重复性试验：取YPF-P的衍生化产物连续6次进样测定；稳定性试验：取YPF-P的衍生化产物分别在0、2、4、8、16、24 h进样。回收率试验：在样品中添加相当于样品含量一半的100%、120%和150%混合单糖标准品，配成3个质量浓度的溶液，进行测定。

2.6 线性考察 混合单糖标准品分别进样1、2、4、6、8、10 μL，用峰面积对各单糖的质量浓度回归。

2.7 各单糖的物质的量比[11]计算方法：按式(1)、(2)计算其中两种单糖间的校正因子f1/2和样品中这两种单糖的比例R1/2。

f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

(1)

A1、A2 分别为混合对照品溶液中单糖1、2 的峰面积，m1、m2 分别为混合对照品溶液中单糖1、2 的质量浓度。

(2)

3 结果

3.1 YPF-P制备和含量测定 最佳提取条件为：料液比1∶16、浸提时间1.5 h、浸提温度90 ℃、提取次数3次，之后抽滤、浓缩提取液，无水乙醇沉淀浓缩液12 h，取沉淀物经真空干燥，得玉屏风复合粗多糖。经AB-8大孔树脂纯化的YPF-P含量可达93%以上。

3.2 方法学考察 精密度试验：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%。

重复性试验：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分别为0.65%、1.36%、1.39%、1.21%、1.20%、1.12%、0.60%。

稳定性试验：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为0.73%、0.78%、1.10%、0.89%、1.17%、1.11%、0.70%。表明样品溶液在24 h内稳定。

回收率试验：计算得D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为101.4%，98.9%，99.7%，98.7%，98.3%，114.4%，110.0%；RSD值为0.29%，0.24%，0.20%，0.92%，0.41%，0.72%，1.86%。

3.3 线性考察 用峰面积对混合单糖标准品中各单糖的质量浓度回归，线性结果见表1。

表1 单糖标准曲线方程

3.4 单糖对照品与YPF-P的HPLC分析色谱图 将混合单糖对照品溶液与YPF-P水解产物分别衍生化后进行HPLC分析，通过单糖对照品图谱得出结果：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分别在24.27、29.68、33.29、36.96、47.28、52.52、56.64 min左右出现吸收峰，见图1；对比YPF-P图谱，在相同的位置也出现的对应吸收峰，只是峰的大小有所不同。可以确定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7种单糖组成，见图2。

图1 单糖对照品溶液HPLC色谱图

1:D-甘露糖； 2:D-核糖； 3:鼠李糖； 4:D-半乳糖醛酸；5:D-葡萄糖； 6:D-半乳糖； 7:阿拉伯糖

图2 YPF-PHPLC色谱图

1：D-甘露糖； 2：D-核糖； 3：鼠李糖； 4：D-半乳糖醛酸；5：D-葡萄糖； 6：D-半乳糖； 7：阿拉伯糖

3.5 YPF-P中各单糖的物质的量比 通过计算得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物质的量比为4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，见表2。

表2 YPF-P中各单糖的物质的量比计算结果

4 讨论

开展兽用中药多糖质量控制的研究，制定国家或行业的质量标准，是创制新型多糖药物或饲料添加剂的重要前提。由于多糖分子量相对较大，结构复杂，使多糖的定性和定量检测成为多糖类新药研发中的瓶颈问题。多糖的常规分离法包括提取、除脂、脱色、除蛋白、醇柱分离纯化、透析等基本步骤[12]，处理过程繁琐复杂。本试验采用AB-8大孔树脂对粗多糖溶液进行分离，提高了分离效率；采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析其单糖组成及其物质量比，解决了多糖和单糖不具有紫外线吸收，无法直接对其进行测定的问题。试验旨在开展YPF-P的质量控制研究，摸索出快捷、有效质控方法，为YPF-P新兽用制剂的创制提供重要的基础数据，也为多糖质量控制方法研究提供参考和借鉴。

试验采用L9(34)正交试验设计优化水提醇沉淀的提取工艺，经AB-8大孔树脂对玉屏风粗多糖进行纯化，使得YPF-P的含量达到93%以上。

对比单糖混合对照品图谱与YPF-P图谱(见图1、2)，可以确定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7种单糖组成。研究表明，在单糖组成的定量分析中，采用只求单糖间的物质的量比的方法，而并不需要确定各单糖的具体质量[13]。本试验得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物质的量比为4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，明确了多糖中各单糖的组分，该结果对YPF-P质量标准的制定有重要意义。

在用高效液相色谱法分析多糖组成及其含量时，一般采用凝胶色谱柱与示差折光检测器或蒸发光散射检测器等仪器，这些方法不仅灵敏度低、基线噪音大、柱温对结果影响较大、测定过程中易发生单糖转化并且这些仪器与色谱柱价格高昂。本试验首次对方剂复合多糖进行单糖组成测定，建立的PMP柱前衍生化-高效液相色谱法分析YPF-P的方法灵敏度高、样品用量少、稳定性好、方法准确可靠，能够很好地分离测定YPF-P的各单糖组分。