蒸汽爆破提取牛膝多糖工艺优化及抗氧化性研究

易军鹏王 赛李 欣杨亚皇赵鹏成朱文学

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023; 2. 河南科技大学化工与制药学院，河南 洛阳 471023)

牛膝(AchyranthisbidentataeRadix)为苋科植物牛膝(AchyranthesbidentataBl.)的干燥根[1]。牛膝属多年生草本，有怀牛膝和川牛膝之分。怀牛膝主要分布在河南，与怀地黄、怀菊花、怀山药并称为四大怀药。怀牛膝中的主要活性物质有三萜皂苷、甾醇类(以蜕皮甾醇为主)、多糖及生物碱等。现代药理研究表明，牛膝多糖具有免疫调节的作用[2]。因此，牛膝在食品药品行业，特别是保健品行业备受关注。

传统的多糖提取工艺普遍得率较低。在传统的水提醇沉提取工艺中，优化后的牛膝多糖得率大约在5.31%[3]。加入超声和微波辅助后，牛膝多糖得率分别提升至12.37%和11.70%[4-5]，但是这2种辅助工艺需要在提取过程中持续加入外界条件，能耗和成本较高。

蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment, SEP)是处理植物木质纤维素最常用的办法[6-7]。它将植物原料浸润在高温高压的水蒸气中，维持几秒至几分钟后瞬时(0.087 5 s)泄压，可以有效地打破原料中植物细胞壁或者表面纤维等抗提取屏障。国内外研究[8-10]表明，蒸汽爆破可使原料溶出率增加，提取率显著提高。该预处理技术已应用于粮食、油脂和中草药等[11-14]行业。但未见对牛膝蒸汽爆破处理后，其活性成分及抗氧化活性变化的研究报道。本研究拟以河南产怀牛膝为原料，多糖得率为指标，优化了牛膝的蒸汽爆破处理条件，并研究了蒸汽爆破预处理对牛膝多糖清除DPPH自由基和O2-自由基能力的影响，以期为牛膝多糖活性的提高提供有力的参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛膝：购于河南省洛阳市张仲景大药房，经河南科技大学林学院林晓民教授鉴定为怀牛膝，产地焦作；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)： 上海伊卡生物技术有限公司；

无水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚等：分析纯，天津德恩化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

间歇式蒸汽爆破机：QBS-80型， 鹤壁正道生物能源有限公司；

高速冷冻离心机：DS-1型，上海生析超声仪器有限公司；

分析天平：FA-1005型， 上海仪器有限公司；

电子扫描显微镜：JSM-5610LV型，日本电子株式会社；

紫外可见分光光度计：UV-2400型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

差示量热扫描仪(含铝坩埚)：DSCⅠ型，瑞士MEttler-Toledo公司；

傅里叶红外变换光谱仪：TENSPOR27型，德国Bruker公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牛膝蒸汽爆破预处理 将干燥的牛膝根块用等梯度比例的去离子水预浸泡6 h，放入蒸汽爆破机物料仓(每次约100 g)中，通入饱和蒸汽，选取不同梯度维压时间和蒸汽爆破压力，在微秒内(0.087 5 s)完成释压，实现蒸汽爆破(预浸泡含水率、蒸汽爆破维压时间和汽爆压力选取详见1.3.3 单因素试验)。预处理后的样品在使用前需要置于50 ℃干燥至恒重。另取一部分未经蒸汽爆破处理的干燥牛膝作为空白对照。

1.3.2 牛膝粗多糖热回流提取 将蒸汽爆破处理和未处理的牛膝分别粉碎过筛，各取粒度为40～60目的样品。设定水浴温度为60 ℃、水浴时间2 h，采用l∶15 (g/mL)的料水比提取牛膝多糖，将提取液浓缩至原体积的1/4，再加入3倍体积无水乙醇4 ℃下过夜沉淀，4 500 r/min离心10 min后取沉淀，用乙醇、乙醚和丙酮各洗涤1次来除去小分子物质，沉淀用等体积水复溶，并用Sevag法除蛋白。粗多糖含量采用苯酚—硫酸法进行测定，以葡萄糖为标品，得到标准曲线方程y=0.011 3x-0.016 7 (R2=0.997)。牛膝粗多糖提取率按式(1)计算。

(1)

式中：

S——牛膝多糖得率，%；

c——多糖溶液浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

D——稀释倍数；

m——牛膝样品质量，g。

粗多糖的热力学分析和红外表征，以及抗氧化研究均选取最优蒸汽爆破工艺条件下预处理得到的牛膝多糖产品，检测前真空冷冻干燥(冷阱温度-40 ℃，真空度≤100 Pa，处理24 h)，得到粉末状粗多糖制品。

1.3.3 蒸汽爆破预处理工艺优化

(1) 单因素试验：蒸汽爆破工艺的优化选取预浸泡含水率、维压时间和汽爆压力3个因素，每个因素设5个水平，考察汽爆压力为0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 MPa；维压时间为0，30，60，90，120 s；预浸泡含水率为0%，5%，10%，15%，20%时的多糖提取率。当一个因素变化时，控制其它2个因素固定在预浸泡含水率10%，或汽爆压力1.5 MPa，或维压时间60 s。

(2) 响应面试验设计：在单因素优化试验的基础上，确定预浸泡含水率、汽爆压力、维压时间3个独立变量，以牛膝多糖提取率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，对牛膝蒸汽爆破工艺采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计，并利用Design-Expert软件进行数据分析，优化蒸汽爆破工艺参数。单次试验重复3次，试验结果取平均值。

1.3.4 牛膝微观结构的观察 用导电胶将样品粘到样品台，通过离子溅射技术对其进行喷金处理，设定加速电压20 kV，电流15 mA，用扫描电子显微镜进行观察。

1.3.5 牛膝多糖热力学分析 采用差式量热扫描仪(DSC)进行分析。准确称取(10±0.1) mg牛膝多糖，置铝坩埚中并压实密封，以密封空铝坩埚做参比，在30 ℃下平衡1 min，再以20 ℃/min的速率升温加热，使机器温度由30 ℃上升到280 ℃，氮气流速40 mL/min，记录各个样品不同温度热处理的DSC热相图。

1.3.6 牛膝多糖红外表征 对牛膝多糖进行溴化钾压片法制样(样品和溴化钾质量比约为1∶20)，用傅里叶变换红外分光光度计在室温下，各样品在波长4 000～400 cm-1内进行扫描并记录红外光谱图。

1.3.7 牛膝多糖体外抗氧化活性

(1) DPPH清除自由基测定：参考孙玉林等[15]的方法做适当修改，准确配制摩尔浓度为0.1 mmol/ L 的DPPH-乙醇溶液，现配现用。多糖样品用蒸馏水配制不同浓度的样液，VC做阳性对照，取2 mL样液和2 mL DPPH溶液于试管中，涡旋均匀后室温避光放置20 min，在517 nm处测定吸光值A1，A2用无水乙醇代替DPPH溶液，A0为蒸馏水和DPPH溶液。按式(2)计算自由基清除能力。

(2)

式中：

KDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——样品吸光值；

A2——对照吸光值；

A0——空白吸光值。

(3)

式中：

A1——样品吸光值；

A0——空白吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 预浸泡含水率对牛膝多糖得率的影响 由图1可知，预浸泡含水率对牛膝多糖的得率产生影响。随着预浸泡含水率的增加，多糖得率呈先增加后趋于平稳的趋势。预浸泡含水率对多糖提取率的影响是由于使用的原料为干燥的牛膝，若直接进行蒸汽爆破，水分不能充分渗透物料内部。增加水的预浸泡会使物料溶胀，可在蒸汽爆破过程加快蒸汽的渗透，从而在泄压瞬间增大机械剪切力[17]。当预浸泡含水率为10%时，牛膝已完全溶胀，再增大预浸泡水量，对多糖提取没有明显影响。

图1 预浸泡含水率对牛膝多糖得率的影响

2.1.2 蒸汽压力和维压时间对牛膝多糖得率的影响 蒸汽爆破设备的2个参数蒸汽压力和维压时间决定了蒸汽爆破的反应强度，影响蒸汽爆破处理物料的结果，进而关系到牛膝多糖的得率(图2～3)。随着蒸汽爆破压力的增大和维压时间的增长，牛膝多糖得率均呈先增加后降低的趋势。由图2、3 可知，蒸汽爆破压力1.5 MPa和维压60 s时得率最高。这可能是由于随着蒸汽爆破强度越强，越能有效地打破物料内部抗提取屏障，可加速多糖的溶出，Sui等[18]曾报道过，蒸汽爆破促使了物料内部多孔网络的产生和放大，改变多孔性质从而改善了萃取过程；另一个原因可能是蒸汽爆破会使半纤维素降解，释放出降解产物水溶性多糖，导致了多糖产率的增加，Sun等[19]的研究曾证实过该观点。但当蒸汽爆破压力继续增加时，牛膝多糖得率会下降，推测是由于巨大的机械剪切力使糖苷键进一步断裂[20]，多糖降解成为寡糖或单糖等，在提取过程中无法醇沉或被洗掉。

图2 维压时间对牛膝多糖得率的影响

图3 蒸汽爆破压力对牛膝多糖得率的影响

2.2 响应面优化提取工艺

以牛膝多糖提取率为指标，通过Box-Benhnken响应面法对蒸汽爆破处理牛膝工艺进行分析，得到多元二次回归模型方程式：

(4)

Box-Behnken试验因素和水平见表1，响应面设计方案及结果见表2。

表1 Box-Behnken试验因素和水平表

表2 响应面设计方案及结果

蒸汽爆破各因素对牛膝多糖得率影响响应面及等高线见图4。各因素之间交互作用的强弱能够由等高线的形状反映，圆形说明两因素交互作用不显著，椭圆形则相反。从图4可以看出，含水率与维压时间的交互项呈现出典型的椭圆形，说明交互作用显著。此外，沿维压时间轴方向的等高线密度变化略高于含水率方向的变化，说明维压时间对多糖得率的影响较大。其余两交互因素等高线的形状趋近于圆形，未达显著水平。

通过模型预测，得到蒸汽爆破工艺的最优值为预浸泡含水率11%，蒸汽爆破压力1.57 MPa，维压时间63.14 s，在相同提取条件下，多糖得率为11.90%。为检验得到的结果是否准确，采用上述蒸汽爆破优化条件，考虑到多位小数不利于实际操作，蒸汽爆破工艺参数修正为：预浸泡含水率11%，蒸汽爆破压力1.6 MPa，维压时间63 s时，在此条件下多糖得率为11.88%，实际测量值与理论值相接近，差异不显著。本试验采用蒸汽爆破处理样品，在相同提取条件下高出未经爆破处理的近2倍。这与当前倪辉等[8]、孙俊良等[9]的研究结果均一致。蒸汽爆破技术是纯物理手段，从生产成本和绿色安全上考虑，是一种短时高效的方法。采用修正后的方法得到的蒸汽爆破参数准确可靠，具有一定实用价值。

图4 各因素交互作用对牛膝多糖得率影响的三维曲面图

变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型51.1195.68151.44<0.000 1**X16.4316.43171.36<0.000 1**X21.3711.3736.520.000 5**X32.7412.7473.01<0.000 1**X1X20.2110.215.520.051 1X1X32.2512.2560.00<0.000 1**X2X30.1710.174.480.072 0X214.3214.32115.16<0.000 1**X2221.08121.08562.24<0.000 1**X239.0419.04241.06<0.000 1**残差0.2670.04失拟项0.1930.063.730.117 8不显著净误差0.0740.02总误差51.3716

2.3 蒸汽爆破对牛膝扫描电镜表观的影响

蒸汽爆破处理和未处理的牛膝电镜图见图5。未处理牛膝表面坚硬，结构致密有序，且表面附着颗粒状物质，这与刘传敏[21]的研究结果相似。由图5(b)可知，蒸汽爆破可极大地改变牛膝的微观结构，表皮层受到严重破坏，纤维结合变得松弛，有很大程度的断裂，出现较大的沟壑和空洞，推测是由于半纤维素的断裂和降解，这一现象与许丙磊[22]的发现一致，也与王风芹等[23]报道的结果相似。从图5(d)可以看出，由于蒸汽爆破的作用，牛膝表面颗粒状物质明显增多。蒸汽爆破对牛膝结构的破坏，会使多糖提取过程中，溶剂更容易渗入到牛膝内部，使提取更加完全，这与蒸汽爆破处理后，牛膝多糖得率增高的结果相一致。

图5 蒸汽爆破处理和未处理牛膝扫描电镜图

Figure 5 Scanning electron micrographs of steam-explosion pretreated and untreatedAchyranthesbidentataRadix

2.4 蒸汽爆破对牛膝多糖热稳定性的影响

经汽爆处理后的牛膝多糖(SEP)与未爆破的牛膝多糖的DSC分析见图6和表4。2种多糖均具有2个吸热峰(峰1和峰2)和一个放热峰(峰3)。1号吸热峰可能是较低温度下，多糖的自由水和结合水的蒸发吸热。2号吸热峰推测为大分子多糖的初步降解所需的热量，未处理的多糖和汽爆后的多糖分别在178.99，184.04 ℃开始分解。汽爆后，牛膝多糖的焓变值由6.87 J/g降至5.23 J/g，峰值温度由191.50 ℃升到197.83 ℃，推测是由于汽爆过程中，部分大分子多糖有一定程度的降解导致。3号峰为一个放热峰，是由于多糖热解或氧化分解产生的热。汽爆后，牛膝多糖在该行为下变为宽峰，并且热焓(6.79 J/g)远低于未处理多糖的热焓(62.64 J/g)。

图6 蒸汽爆破处理和未处理牛膝多糖DSC曲线

2.5 牛膝多糖红外表征

通过傅里叶红外光谱扫描对牛膝多糖主要的官能团进行表征。如图7所示，未爆破处理牛膝多糖的红外光谱图中，代表O—H的3 310 cm-1左右宽阔的吸收峰和代表C—H 的2 938 cm-1左右的强吸收峰为多糖结构的主要谱带[24]。在1 020 cm-1处的吸收，表明糖单元中C—O—C的变形振动[25]。2 935 cm-1处吸收峰为C—H的亚甲基峰，928 cm-1处的尖峰为呋喃环的吸收峰[26]，由此可判断该提取物是一种呋喃型杂多糖。方积年等[27]曾从牛膝中分离出肽多糖，因此1 654，1 548 cm-1处的强吸收特征峰应为羰基键的伸缩振动和N-H键的弯曲振动[28]。蒸汽爆破处理后，多糖在3 411 cm-1左右的O—H和2 939 cm-1左右的C—H特征谱带被保留。由图7中a谱带可知。在1 740 cm-1处出现较强吸收峰，应为C=O的伸缩振动[29]，同时1 548 cm-1处代表N—H的吸收峰消失。

表4 牛膝多糖的热力学参数

a. 蒸汽爆破处理 b. 未汽爆处理

2.6 牛膝多糖体外抗氧化活性

图8可以看出，牛膝多糖对2种自由基的清除能力都随着浓度的增加而增强。对汽爆处理后和未处理的牛膝多糖清除自由基能力的比较，可以看到汽爆处理后，牛膝多糖的抗氧化能力明显增强，最大清除率相比于未处理组显著增加，原因是蒸汽爆破使一部分被包裹的多糖释放出来，增加了多糖的含量和种类，从而提升了多糖的抗氧化活性。但均低于相同浓度的VC。在图8(a)中，当样品浓度为2 mg/mL 时，未处理组的DPPH自由基清除率达到77.9%，而汽爆处理组的清除率为90%。在图8(b)中，同样可以看出汽爆后的牛膝多糖对超氧自由基的清除率显著提高，是未爆破组的1.3倍左右，汽爆处理组的IC50均低于未爆破处理组的。

3 结论

将蒸汽爆破技术应用于牛膝的预处理，可显著提高牛膝多糖的提取率和抗氧化活性。经响应面分析法优化牛膝预处理的最优工艺参数为预浸泡含水率11%，汽爆压力1.6 MPa，维压时间63 s。经实验验证，此条件下预处理的牛膝多糖得率为11.88%，约为未处理的2倍。汽爆处理后，牛膝表面出现大的沟壑和空洞，比表面积增大，传质阻力减小；牛膝多糖在热稳定试验中表现在裂解吸热过程中焓变值的降低，峰值升高，放热过程中焓变值的显著降低；随着蒸汽爆破强度的增加，可有效加强牛膝多糖对DPPH和超氧自由基的清除能力。本试验结果为蒸汽爆破技术在植物多糖提取工艺中的应用提供了一定的理论依据。

图8 牛膝多糖对DPPH自由基和超氧自由基的清除作用

Figure 8 Effects of scavenging DPPH radicals and superoxide radicals by steam-explosion pretreated and untreated AbPS