玛咖对SD雌性大鼠体内能量代谢的影响及机理

朱玉竹朱 萍

(1. 云南农业大学附属中学，云南 昆明 650200；2. 重庆大学生物工程学院，重庆 400044)

玛咖(LepdiummeyeniiWalp, Maca) 原产于海拔3 500～4 000 m 的秘鲁安第斯山脉(AndesPeru)，为十字花科(Brassicaceae)独行菜属(Lepidium)草本植物[1-2]。自2011年中国卫生部批准玛咖粉作为新食品原料以来，中国玛咖种植和加工均迎来了快速的发展。玛咖含有丰富的多糖、玛咖烯、玛咖酰胺等是药食同源作物，具有增强性功能[3]，抗疲劳、抗氧化[4]，减缓更年期综合症[5]等作用。已研究表明，云南产不同色型(紫、白、黄、黑)，不同产地(会泽、丽江、文山等)的玛咖在营养物质及生理功能上存在差异，如：云南产玛咖生物碱含量依次为黄色(2.224 1 mg/g)、白色(2.919 3 mg/g)、紫色(4.407 8 mg/g)，差异达到极显著水平(P<0.01)[6]；多糖含量为紫色(7.02%)>黑色(6.93%)>绿色(6.75%)>黄色(6.53%)[7]；另外，不同色型(紫、黄、白)玛咖在抗疲劳、降血脂、抗氧化、增强免疫等方面的效果也存在差异，其中紫色玛咖效果最好，白色玛咖效果较差[8]。徐梓荷[9] 49-62研究了云南产不同色型和产地玛咖对性功能效果的影响，结果表明不同产地效果大小排序为：会泽>丽江>秘鲁；不同颜色效果大小排序为：黑色玛咖>紫色玛咖>黄色玛咖。

机体功能的发挥与机体内能量代谢紧密相关，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)途径和腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)途径在细胞内共同构成一个能量合成与分解代谢的开关[10]。在营养充足的情况下，ATP的合成增加，mTOR被激活，磷酸化一系列蛋白底物，刺激细胞利用营养物质[11]。而mTOR-AMPK信号通路又受上游营养因子、生长因子和能量等刺激的影响，而玛咖对机体内能量代谢是否有影响，以何种细胞刺激信号进行，尚不清楚。本试验拟研究云南产不同色型玛咖对SD雌性大鼠机体能量代谢的影响及机理，以期为玛咖的应用与开发提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD雌性大鼠：体重150～160 g，40只，动物许可证号 SCXK (渝)20120008，重庆腾鑫生物技术有限公司；

基础饲料：重庆腾鑫生物技术有限公司；

玛咖：云南省刚捷生物科技有限公司；

RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)：美国普洛麦格公司；

胰岛素样生长因子-1(IGF-1) Elisa试剂盒、胰岛素(InS) Elisa试剂盒：上海桥杜生物科技有限公司；

肝/肌糖原测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

M.MLV反转录酶：美国普洛麦格公司；

荧光定量试剂/膜/板子、SYBR Green Supermix：美国Bio-Rad公司；

Trizol：美国Invitrogen公司。

1.2 仪器与设备

微量紫外分光光度：Nano Drop 2000型，美国 Thermo 公司；

冷冻离心机：3-18k型，德国Sigma公司；

荧光定量 PCR 仪：Light Cycler Nano型，美国罗氏公司；

梯度PCR仪：S1000型，美国Bio-Rad公司；

全自动生化分析仪：HITACHI-7020型，日本株式会社日立制作所；

全自动氨基酸分析仪进行：L-8800型，日本株式会社日立制作所；

酶标仪：H1MG型，美国基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验样品的制备与剂量确定 将玛咖切片后于50 ℃烘干至恒重，经中药粉碎机粉碎后过150 目筛。取玛咖干粉6 g溶于1%羧甲基纤维素钠溶液并定容至50 mL，即得0.12 g/mL 样品悬浮液，4 ℃保存备用[9]51[12]。

玛咖成人每日推荐摄入量为25 g，中国人均体重60 kg[13]，即成人每日用玛咖剂量为0.42 g/kg·BW[12,14]。

1.3.2 动物分组和饲养 将40只SD雌性大鼠按体重随机分为空白对照、黑玛咖、紫玛咖、黄玛咖、白玛咖组，每组8只。每只大鼠独立饲养于不锈钢笼(25 cm×15 cm×15 cm)里，动物房温度控制在(25±1) ℃，相对湿度55%，昼夜循环周期12 h，试验组每日灌胃0.42 g/kg·BW的1%羧甲基纤维素钠玛咖干粉(150目)悬浮液，空白组灌胃等体积1%羧甲基纤维素钠溶液，饲养期间自由采食基础饲料和饮水，每天记录大鼠采食量，每3 d称重1次，同时调整灌胃量，喂养28 d，禁食12 h后称重[12]。用乙醚麻醉后，断头，用含有肝素钠的采血管采血，4 000 r/min、4 ℃离心15 min后，-80 ℃ 冻存，备用。采完血后，快速将大鼠解剖，用4 ℃生理盐水清洗肝脏、骨骼肌、肾脏等组织表面血水，用吸水纸擦干，称总重；称取肝脏组织约100 mg，置于2 mL无RNA酶的微型离心管中，液氮速冻后，-80 ℃冻存，备用。

1.3.3 腹脂率和相对组织重的测定 参考文献[15]，按式(1)、(2)计算腹脂率和相对组织质量。

(1)

(2)

式中：

c1——腹脂率，%；

c2——相对组织质量，%；

m1——附睾周围脂肪质量，g；

m2——肾脏周围脂肪质量，g；

m3——组织质量，g；

m——活体质量，g。

1.3.4 生理生化指标分析 采用尾部静脉采血，血糖仪测定其空腹血糖；肝/肌糖原采用蒽酮比色法测定，具体操作按试剂盒操作说明书进行；胰岛素和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)采用酶联免疫法测定，操作方法按试剂盒说明书进行；血清及组织中氨酸含量采用全自动氨基酸分析仪测定。

1.3.5 肝脏中关键基因qRT-PCR分析 根据文献[15]修改如下，利用Qiagen试剂盒提取和反转录获得cDNA后，RNA浓度和纯度(OD260 nm/OD280 nm)采用紫外分光光度计进行测定；实时定量PCR测定各组织mRNA含量；内参基因为β-肌动蛋白(ACTB)，qRT-PCR引物序列见表1。qRT-PCR在实时定量PCR仪上进行分析。10 μL的qRT-PCR反应体系包含：4.2 μL SYBR Green Supermix，4.2 μL DEPC水，100 ng/μL cDNA模板1.0 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.3 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；40次循环包含95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s；65 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s。每个样品均设置3次重复。

表1 各基因引物序列及产物长度

1.4 统计分析

试验结果以mean±SD表示，各组间比较采用单因素方差分析，用Duncan法分析显著性，P<0.05被认为有显著差异，各组间差异显著性采用SPSS 21.0软件分析，Origin 9作图。

2 结果与分析

2.1 玛咖对试验大鼠生长的影响

由表2可知，与空白对照组相比，试验组大鼠体重均有增加趋势，其中黑玛咖、紫玛咖和黄玛咖对试验大鼠体重的增加量影响显著(P<0.05)；试验组大鼠相对骨骼肌均有增加趋势，其中黑玛咖和紫玛咖效果显著(P<0.05)，而对肝脏和肾脏相对重量的影响不显著(P>0.05)；各试验组均有降低腹脂率的趋势，提示玛咖可能通过调节能量分配来改变试验大鼠胴体的组成。

2.2 玛咖对试验大鼠生理生化指标的影响

玛咖对试验大鼠血糖和糖原含量的影响见表3。血糖和糖原水平在一定程度上反映了机体能量代谢的状态[16]。在动物体内，机体各组织细胞的活动及功能的发挥所需能量主要来源于血糖，而糖原是机体内糖的储存形式，在机体血糖降低时，肝糖原可迅速分解，以维持机体血糖水平的稳定[17]。试验结果表明，玛咖对试验大鼠血糖的影响不显著，但可增加肝糖原含量的趋势，其中黑玛咖、紫玛咖增加量显著(P<0.05)，可能与玛咖中含有大量的多肽有关。现有研究[18-20]表明，玛咖多肽可促进小鼠肝内糖质新生，从而提高其肝糖原的储备。而体内糖原的储备水平，可直接影响机体的抗疲劳和运动能力[21-22]。Ins和IGF-1在机体肝脏、肌肉及脂肪组织中对糖、脂肪、蛋白质等营养物质的代谢和贮存起作关键作用[23]。灌胃玛咖后各试验组大鼠血清中Ins和IGF-1的含量变化均不显著(P>0.05)。可知，Ins/IGF-1并非灌胃玛咖促进机体能量代谢的主要信号因子。

表2 玛咖对试验大鼠生长的影响†

† 同列a,b,c表示各组之间存在显著差异(P<0.05)。

表3 玛咖对试验验大鼠血糖和糖原含量的影响†

† 同列a,b,c表示各组间存在显著差异(P<0.05)。

2.3 玛咖对试验大鼠血清和肝脏中氨基酸含量的影响

玛咖对试验大鼠血清和肝脏中氨基酸含量的影响见表4、5。生糖氨基酸可在机体内能够转化为葡萄糖，并供能。与空白对照组比，黑玛咖和紫玛咖可显著(P<0.05)血清中Asn、Arg和Ser的含量。另外，各试验组均有增加血清中Gln 的趋势，但不显著(P>0.05)。玛咖可增加试验大鼠肝脏中Asp、Ser、Thr和Ala的含量，其中黑玛咖和紫玛咖可显著(P<0.05)增加试验大鼠肝脏中Asp、Ser、Thr和Ala的含量；对其它各种检测到的氨基酸含量影响不显著(P>0.05)。黑玛咖和紫玛咖增加试验大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸，多为非必需氨基酸。在机体内，非必需氨基酸可由体机相应的α-酮酸自身合成或者蛋白质的分解产生。

当机体能量充足时，氨基酸通常很少或不参与供能，而作为蛋白质合成原料，增加机体蛋白质合成[24]，这与黑玛咖和紫玛咖可提高大鼠骨骼肌相对重量的结果相吻合。支链氨基酸(Branched-chain amino acid, BCAA)包括Leu、Ile 和Val。现有研究[25]表明，支链氨基酸不但是必需氨基酸，也是功能性氨基酸。本试验结果表明，各试验组玛咖均可有上调试验大鼠血清和骨骼肌中Leu和Val的含量。而亮氨酸可刺激mTOR信号通路[26]，从而启动mTORC1 ser2448磷酸化[27]。

表4 玛咖对试验大鼠血清中氨基酸含量的影响†

† 同列a,b,c表示各组间存在显著差异(P<0.05)。

表5 玛咖对试验大鼠肝脏中氨基酸含量的影响†

† 同列a,b,c表示各组间存在显著差异(P<0.05)。

2.4 玛咖对试验大鼠肝脏组织中能量代谢关键基因mRNA表达量的影响

玛咖对试验大鼠肝脏组织中能量代谢关键基因mRNA的影响见图1。能量代谢平衡调控是由多个与之相关的信号通路所介导，其中AMPK信号通路和mTOR信号通路在细胞内共同构成一个合成代谢和分解代谢过程的开关。当机体[AMP]/[ATP]比值升高，可激活 LKB1，通过激活AMPK-TSC2，抑制mTOR活性。本试验结果表明，各试验组均显著 (P<0.05)上调试验大鼠肝脏mTORmRNA表达量；有上调AKTmRNA表达量的趋势，其中黑玛咖和紫玛咖上调显著(P<0.05)。而对AMPK、LKB1 mRNA表达量的影响不显著(P>0.05)。氨基酸和葡萄糖等能量底物通过三羧酸循环改变细胞内AMP和ATP的比例，能量水平降低时，v-ATPase-Ragulator接近LKB1 从而激活AMPK；能量水平较高时，mTORC1与之结合并被激活，开启合成代谢通路。同时，AMPK 是mTOR通路上游主要的激酶，被激活后能磷酸化TSC2蛋白，下调Rheb-GTP，从而抑制mTORC1活性；也可磷酸化接头蛋白Raptor从而阻碍Raptor与mTOR的结合[28]。另外，BCAA还可激活PI3K，进而磷酸化AKT(ser437)，激活mTORC1[29-30]，也可直接作用于mTOR，使mTOR活化[31-32]。综合以上结果表明，支链氨基酸是灌胃不同色型玛咖激活mTOR的信号因子。

图1 玛咖对试验大鼠肝脏组织中能量代谢关键基因mRNA 相对表达量的影响

Figure 1 Effects of Maca on mRNA levels of key genes of energy metabolism in the liver of rats (n=8)

3 结论

食用玛咖可通过调节能量分配来改变机体的组成，其机理可能是通过BACC作用于mTOR，使mTOR活化；可能存在以下信号通路：① BACC激活PI3K后使AKT(ser 437) 磷酸化，激活 mTORC1；② BACC直接作用于mTOR；③ 以上2种情况并存。其中黑玛咖和紫玛咖对机体能量代谢的影响效果显著(P<0.05)高于黄玛咖和白玛咖。

本试验仅从mRNA水平进行了探索，下一步将从蛋白质水平、细胞水平、肠道健康、玛咖粉碎粒度，及食用时间对机体能量代谢的影响及机理进行深入研究。