高效液相色谱法对鲢鱼、鳙鱼和草鱼肌肉中氨基酸含量的测定

李 燕，谢 勇，杨发辉

（1.重庆市水产科学研究所，重庆 江北 400020；2.重庆市荣昌区农业委员会，重庆 荣昌 402460）

鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和青鱼（Mylopharyngodon peters）合称四大家鱼，是我国主要的淡水经济鱼类［1，2］，在西南地区前3种的产量和消费量更大，因肉质鲜嫩，价格便宜成为内陆群众水产品的首选。目前它们的养殖技术成熟［3－5］、养殖规模大、价格便宜。目前对它们营养成分的研究较少，研究面较窄，且用高效液相色谱仪检测的较少，本试验检测了四大家鱼中鲢鱼、鳙鱼、草鱼的营养价值。

氨基酸的检测方法有离子交换色谱法［6－8］、高效液相色谱法［9－15］、气相色谱法［16］、毛细管电泳法［17］等，目前国标检测方法所用的是氨基酸分析仪离子交换色谱法，但高效液相色谱仪因使用范围广，价格较氨基酸分析仪便宜，很多机构和学者也在尝试用高效液相色谱仪检测水产品中的氨基酸含量，本试验建立了用高效液相色谱仪的紫外检测器（DAD）和荧光检测器（FLD）检测氨基酸的方法，该方法操作简单，试剂用量少，准确度高，可为其他科研或检测机构检测氨基酸提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司，配紫外和荧光检测器；BT25S型十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DHG－90HA型电热鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵，巩义市科瑞仪器有限公司。

17种氨基酸标准品：浓度为1 nmol/μL，每支1 mL，中国计量科学研究院。

邻苯二甲醛（OPA）、9－芴甲基氯甲酸酯（FMOC）、硼酸缓冲液均为进口分装好的试剂，密度分别为10 mg/mL、0.78 g/mL 和 1.00 g/mL（pH=10.2），可直接使用。

磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈均为进口色谱纯，霍尼威尔。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制 取1 mL氨基酸标准品，转移至10 mL容量瓶中，用超纯水反复润洗盛装标准品的安培瓶，洗液合并倒入容量瓶内，定容至10 mL，配制成100 nmol/mL的混标。再配制浓度为100、80、50、25、10 nmol/mL的混标，4℃保存。

1.2.2 样品的制备 取鱼肌肉匀浆，105℃烘干（恒重法）研磨成粉，过40目筛，称取约30 mg干样于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液，用氮气吹扫5 min，水解管连接到真空泵上，抽气10 min，放入鼓风干燥箱内110±1℃水解24h。水解完后用12mL 6 mol/L的氢氧化钠中和至弱碱性，定容至25 mL，待测。

1.2.3 色谱条件 试验建立了能实现标准品溶液和样品溶液的自动衍生化过程。自动进样器自动进样设置见文献［18］。

流动相 A：40 mmol/L 的 Na2HPO4，pH 7.8（称取6.2 g NaH2PO4·2H2O 定容至 1 L，用 6 mol/L 的氢氧化钠调 pH 至 7.8）；流动相 B∶乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10。 色谱柱：Eelipse－AAA 色谱柱，4.6 mm×150 mm，5 μm。二极管阵列检测器 （DAD）和荧光检测器（FLD）。DAD 波长设置：0～16 min，检测波长为 338 nm，10 nm带宽，参比 390 nm，20 nm 带宽；16 min后检测波长为262 nm，16 nm带宽，参比324 nm，8 nm带宽；峰宽都为 0.1 min。 FLD 波长设置：0～15.5 min，激发波长为340 nm，发射波长为450 nm，增益10；15.5 min后激发波长为266 nm，发射波长为305 nm，增益9；峰宽都为0.2 min。柱温40℃。梯度洗脱条件见表1，流速2 mL/min。

表1 梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 氨基酸标准曲线

配制浓度为 100、80、50、25、10 nmol/mL 的 17种氨基酸混标，同时用DAD和FLD进行检测。结果表明，17种氨基酸均能被DAD检测，线性相关系数在 0.9985～0.9999；除半胱氨酸外的其他 16 种氨基酸均能被 FLD 检测，线性相关系数在 0.998 1～0.999 9；线性关系均较好，标准品的DAD谱图和FLD谱图见图1和图2，各氨基酸的标准曲线及相关系数见表2。

图1 17种氨基酸标准品的DAD图谱

图2 16种氨基酸标准品的FLD图谱

表2 各氨基酸的回归方程、相关系数

2.2 重现性、检出限和定量限

用5 nmol/mL的氨基酸混合标准液连续进样6次，FLD检测器检测，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）表示仪器的重现性。

当各氨基酸的信噪比为3时，以此时的标准品浓度或质量为检出限，本试验用10 nmol/mL的氨基酸混合标液来测定DAD检测器的检出限，用1 nmol/mL的氨基酸混合标液来测定FLD检测器的检出限。

当各氨基酸的信噪比为10时，以此时的浓度为定量限，本试验的定量限由检出限换算而得。

对比DAD检测器和FLD检测器的检出限，FLD的检出限和定量限都更低；FLD能检测1 nmol/mL的氨基酸混合标样，谱图效果较好，能清楚地区分各个峰；DAD检测器能检测10 nmol/mL的氨基酸混合标样，谱图效果较好。各种氨基酸的重现性、检出限、定量限的数据如表3所示。

表3 检出限、定量限和重现性

2.3 样品分析结果

鲢鱼、鳙鱼、草鱼的氨基酸水解液经检测后，17种氨基酸含量以DAD的检测结果来统计，必需氨基酸含量以FLD和DAD检测结果的平均值来统计（图3至图8、表4）。结果表明，鲢鱼的氨基酸总量为145.46 mg/g，其中必需氨基酸占总氨基酸的35.75%；鳙鱼的氨基酸总量为 127.49 mg/g，其中必需氨基酸占总氨基酸的34.67%；草鱼的氨基酸总量为124.10 mg/g，其中必需氨基酸占总氨基酸的36.24%。

3 小结与讨论

经查阅文献得知色氨酸需要碱水解［19］后才能检测，本试验用的是酸水解方法，因此文中未涉及色氨酸的检测数据，但该上机检测方法同样适用于色氨酸。样品放入鼓风干燥箱内水解前，抽真空要足够长（每个样品至少抽5 min），并要防止漏气，如水解后消解用的盐酸体积变小，有可能是漏气，会使检测结果偏低。

图3 鲢鱼样品的FLD检测结果

图5 鳙鱼样品的FLD检测结果

图6 鳙鱼样品的DAD检测结果

图7 草鱼样品的FLD检测结果

图8 草鱼样品的DAD检测结果

表4 鲢鱼、鳙鱼、草鱼的氨基酸含量 （单位：mg/g）

目前用高效液相色谱仪检测半胱氨酸都是在紫外条件下检测［20］，主要是因为半胱氨酸衍生化后对荧光的吸收差，不能用荧光检测器检测，因此本试验中FLD也只能检测17种混标中的16种氨基酸。试验所用高效液相色谱仪配备的自动进样器能实现进样时自动吸取样品和衍生试剂完成柱前衍生化过程，在衍生过程中，标液或样品、OPA、FMOC的体积比为1∶1∶1，硼酸盐缓冲液是为了将样品调节为弱碱性，水和乙腈的作用是洗针和稀释的作用。试验尝试不用自动进样器衍生化，采用人工衍生化，按照自动进样器相同的比例精确地取0.5 mL样品或标准品，0.5 mL OPA，0.5 mL FMOC 和 2.5 mL 硼酸盐缓冲液，混合均匀后用精密pH试纸测pH在9左右，呈弱碱性。上机检测结果表明17种氨基酸都能检出，但重现性较自动进样器差，且所消耗的标准品和衍生试剂较多。

采用氨基酸柱，以磷酸氢二钠、甲醇、乙腈、水为流动相，建立了OPA－FMOC试剂联用柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析方法，标准品和样品同时用DAD和FLD检测，在26 min内17种氨基酸能较好的分离。样品在两个检测器上的检测结果相差很小，在判定必需氨基酸含量时取两个检测结果的平均值。结果表明，鲢鱼、鳙鱼和草鱼肌肉内至少含有17种氨基酸，必需氨基酸占总氨基酸比例分别为35.75%、34.67%、36.24%，与孔保华等［21］、姜启兴等［22］、王雪峰等［23］所报道结果基本一致。