云南武定鸡肠道芽孢杆菌分离鉴定及动物饲喂试验分析

韩建强，卢志远，杨锁住，赵国洪，张以芳，赵 津*

(1.玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653106；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】芽孢杆菌(Bacillus)，革兰氏阳性杆菌或球菌，具有调整肠道微生态[1]、提升饲料的利用率、增强动物体免疫功能[2-4]、抵抗病原微生物[5-6]、减少疾病的爆发的作用，无毒、无害，可用作饲用微生物制剂。【前人研究进展】傅义刚等的研究表明饲料中加入适量的芽孢杆菌可以显著提高肉鸡体内的淀粉酶和总蛋白酶含量，对生长发育和饲料的利用率都远高于没有饲喂的肉鸡[7]。Momgkol[8]等研究显示在饲料中添加0.2 %～0.5 %的纳豆枯草芽孢杆菌能明显提升肉鸡的生产性能。【本研究的切入点】从武定鸡肠道中分离出10株芽孢杆菌，通过分离鉴定、耐酸、耐胆盐、肠道粘附、抑菌试验，选择优良的芽孢杆菌，选用1日龄武定雏鸡进行饲喂，测定其体重、免疫器官指数、肠道中乳酸菌含量、料肉比等指标。【拟解决的关键问题】为武定鸡微生物饲料添加剂的研究和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康的武定鸡(体重1600 g左右)—来源于云南武定县周边农户自家养殖没有饲喂添加抗生素饲料的武定鸡。动物实验所用雏鸡来源于云岭广大雏鸡厂。

1.2 主要试剂

TakaRa ExTaq、DL2000TMDNA Maker、DL10000 TMDNA Maker购自大连宝生生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱)购自Bioteke Corporation公司；蛋白酶K、溶菌酶购自MERCK公司；MRS Broth、MRS medium购自北京陆桥技术有限责任公司；细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司，培养基购自天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.3 芽孢杆菌分离鉴定

1.3.1 芽孢杆菌分离培养及染色镜检观察 将小肠除去粪便，无菌剪开用生理盐水冲洗，再将洗下来的样品80 ℃水浴15 min，取1 mL样品倾注于普通琼脂培养基内培养，在37 ℃的恒温培养箱中24 h。挑取单个生长良好的大菌落，进行纯培养及涂片染色镜检观察。

1.3.2 芽孢杆菌生化鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》[9-10]提供的方法进行芽孢杆菌的生理生化鉴定。

1.4 芽孢杆菌饲喂菌株筛选

1.4.1 芽孢杆菌的耐酸能力测定 配置pH值1.5、2.5、3.5、4.5的液体培养基，以pH值为6.5的液体培养基作对照。每6 mL培养基接种300 μl菌液，37 ℃静止培养，12 h后观察培养基中菌体生长状况。

1.4.2 芽孢杆菌的耐胆盐能力测定 配制胆盐浓度为0.1 %、0.2 %、0.3 %、0.4 %(W/V)的液体培养基，以不加胆盐的液体培养基作对照，在每6 mL的培养基中接种300 μl的菌液，于37 ℃培养，接种300 min后取菌液做平板计数。

1.4.3 芽孢杆菌的肠道粘附能力测定 肠黏液的制备：解剖取小肠，无菌生理盐水冲洗3次，剪开肠壁，钝塑料片轻轻刮取肠黏液，无菌PBS混匀，4 ℃、12 000 r/min离心2次，每次15 min。取上清液，用Bradford法测定蛋白含量，用PBS(pH值7.4)调整蛋白浓度为1 mg/mL后在-20 ℃保存备用。

体外黏附实验：肠黏液(1 mg/mL)100 μl加入96孔培养板，4 ℃固定过夜。用PBS洗涤除去未黏附黏液，加100 μl益生菌悬液(108cfu/mL)，30 ℃孵育2 h。用PBS洗涤除去未黏附的益生菌，加50 μl PBS及20 μl MTT(5 mg/mL)，30 ℃孵育1 h后，加裂解液(20 %SDS-50 %DMSO)振荡30 min。用酶标仪测定各孔吸光度值(λ=570 nm)。重复3次，以脱脂奶粉作阴性对照组。益生菌黏附率( %)=(A1-A0)/(A2-A0)×100 %，式中：A1、A2、A0分别是试验组、乳酸菌+原液、空白对照组吸光度值。

1.4.4 芽孢杆菌抑菌实验 将分离的芽孢杆菌在相应的培养基上活化3代，用2 mL灭菌生理盐水将其从平板上洗下制成菌悬液备用；用涂布棒在普通琼脂平板上分别涂布大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；将牛津杯在酒精灯上灼烧灭菌，待稍凉后(50 ℃左右)放置在刚才涂好菌的培养基上；在牛津杯中分别加入200 μl乳酸菌和芽孢杆菌的菌悬液，4 ℃放置2 h；将培养皿放置在37 ℃培养箱，培养24 h；观察平板上大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长情况，并测量抑菌环直径。

1.5 饲用筛选优良菌株雏鸡饲喂试验

1.5.1 优良菌株16S rDNA鉴定 根据GenBank上细菌的16S rDNA基因，合成2条通用引物，扩增16S rDNA基因，目的片段大小为1500 bp，引物序列见表1。引物由华大基因科技股份有限公司合成。

表1 细菌16S rDNA基因通用扩增引物

表2 芽孢杆菌参考菌种

将饲用筛选优良的芽孢杆菌16S rDNA基因PCR产物送华大基因公司进行测序。

1.5.2 优良菌株16S rDNA同源性及系统发育树分析 从GenBank中下载16S rDNA参比序列，选取的参比序列为不同动物品种来源及不同种代表菌株。用于芽孢杆菌属种鉴定的代表菌株16S rDNA参比序列见表2。

1.5.3 优良菌株雏鸡饲喂试验 将实验中所挑选出的抑菌效果、耐酸能力、产酸能力相对较好的菌株饲喂1日龄雏鸡，对照组和试验组分别饲喂20只雏鸡，菌液制成1.0×1010个/mL，每日取5 mL加入95 mL水中饲喂雏鸡。从雏鸡出生的第2天开始喂养，每隔30 d测量1次体重，计算日增重量，并取鸡的法氏囊和脾脏称重，计算免疫器官比，料肉比，统计死亡率。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的生化特性

将分离的菌株进行生化试验(运动性、过氧化氢酶、吲哚试验、明胶液化、V-P实验、硝酸盐还原及厌氧生长试验)和种的生化试验(乳糖、木糖、葡萄糖等糖发酵实验)如表3～4所示，参考《伯杰氏鉴定手册》[9-10]，鉴定含3株枯草芽孢杆菌、3株地衣芽孢杆菌、2株短小芽孢杆菌、2株萎缩芽孢杆菌。

表3 BacC1～BacC10芽孢杆菌生化鉴定结果

注：+为阳性，-为阴性，下同。

Note: positive(+), negative(-), similarly hereinafter.

表4 BacC1～BacC10芽孢杆菌生化鉴定结果

2.2 饲喂芽孢杆菌筛选试验结果

2.2.1 芽孢杆菌耐酸能力测定结果 将所分离的菌株进行耐酸能力测定，BacC1和BacC3的耐酸能力较强。

2.2.2 芽孢杆菌耐胆盐能力测定结果 将所分离的菌株接种到含不同浓度的胆盐液体培养基中，经过300 min培养，BacC1在0.4 %的胆盐浓度下，有相对较高的耐受力。

2.2.3 芽孢杆菌肠道粘附能力测定结果 将所分离的菌株进行肠道粘附能力测定。BacC1肠道粘附能力高于其他菌株。

2.2.4 芽孢杆菌抑菌能力测定结果 采用牛津杯法在体外进行抑菌实验，结果显示：BacC1是其中抑菌效果最好的菌株。

2.3 动物实验结果

2.3.1 优良菌株(BacC1)16S rDNA鉴定结果 对BacC1进行16S rDNA基因片段PCR扩增，目的片段在1500 bp左右，与期望值相符。将测序的芽孢杆菌(BacC1)与Genbank中选用的4株芽孢杆菌，用Blast、Clustal、MEGA等生物软件分析，构建系统进化树(如图1～2)。BacC1与枯草芽孢杆菌亲缘性较近。BacC1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

2.3.2 实验动物增重结果 测定30和60日龄鸡的平均体重并记录，结果显示饲喂芽孢杆菌组的雏鸡的平均增重量显著高于(P<0.05)对照组。有3.5 %的优势(表5)。

2.3.3 实验动物的免疫器官指数 在60日龄采取动物的法氏囊和脾脏称重，计算其免疫器官指数，结果显示饲喂芽孢杆菌组的雏鸡的法氏囊和脾脏的平均重量、免疫器官指数均显著高于(P<0.05)对照组(表6)。

图1 BacC1芽孢杆菌的进化树Fig.1 The phylogenetic tree of strain BacC1

图2 BacC1芽孢杆菌的亲缘性Fig.2 The affinity of BacC1

2.3.4 实验动物肠道中乳酸菌数量 分别取30和60日龄鸡的肠道，处理后在MRS培养基上涂布培养计算肠道中乳酸菌含量。结果显示饲喂芽孢杆菌组的60日龄鸡的肠道中乳酸菌含量显著高于(P<0.05)对照组。有14 %的优势(表7)。

2.3.5 实验动物死亡结果统计 在实验过程中为保证排除抗生素以及疫苗对实验的影响，本实验各组雏鸡均未食用任何含有抗生素的饲料，且没有进行疫苗免疫。结果显示饲喂芽孢杆菌组的雏鸡死亡数低于对照组(表8)。

2.3.6 实验动物料肉比 记录试验动物每日所饲喂的饲料重量，并计算其料肉比，结果显示饲喂芽孢杆菌组的雏鸡料肉比显著(P<0.05)低于对照组(表9)。

2.3.7 淋巴细胞转化实验结果 分离鸡血外周淋巴细胞，以5 μg/mL ConA作为刺激源培养66 h后用CellTiter96AQueous One Soulution Cell Proliferation Assay检测，计算出每组的刺激指数SI，并通过SPSS 19.0软件进行分析，由表10可知混合组的淋巴细胞指数显著高于对照组，差异显著(P<0.05)，单独饲喂乳酸菌各组的淋巴细胞指数高于对照组(P<0.05)，单独饲喂芽孢杆菌组的淋巴细胞指数高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

表5 实验动物日增重量

注：用SPSS19.0的单样本t检验分析可知P<0.05差异显著，下同。

Note： SSPS19.0 software was used to do one-samplettest, and statistical significance was defined asP<0.05, similarly hereinafter.

表6 免疫器官指数

表7 肠道中乳酸菌含量

表8 雏鸡死亡数

表9 料肉比

3 讨 论

国内外关于鸡源芽孢杆菌的分离鉴定相关研究已经很成熟。Gregor[11]等人研究发现鸡肠道中存在有双岐乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、假菌丝酵母菌属、克勒克酵母菌属等。本实验从健康武定鸡肠道中分离出芽孢杆菌10株，经过鉴定确定包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌。分离的枯草芽孢杆菌为中国以及美国官方所公布的可用作饲料添加的菌株。

国内外有较为成熟的益生菌筛选方法，本实验采用常用的耐酸、耐胆盐、产酸、肠道粘附、抑菌等能力指标的测定。筛选适合饲用的优秀菌株。李丽红[12]等在筛选益生菌试验中除上述指标外还进行了耐高温试验，本实验培养益生菌的温度接近鸡的正常体温，因此未进行相关实验内容。

表10 ConA刺激外周淋巴细胞增值反应

本实验通过日增重量、免疫器官指数、料肉比、死亡率和淋巴细胞转化来评价芽孢杆菌的益生效果。由于饲喂时间短，产蛋率以及产蛋重量无法进行测量。

4 结 论

添加BacC1组的武定鸡的体重、免疫器官指数、肠道中乳酸菌含量均显著(P<0.05)高于对照组。而料肉比显著(P<0.05)低于对照组。在饮水中加入芽孢杆菌BacC1可以提高雏鸡的免疫能力和生产性能。研究结果为饲料添加菌株的筛选提供科学依据。