山丹与几种百合的杂交及花粉管生长荧光观察

郭玉洁，杨会娟，曹 宇，刘冬云，2

(1.河北农业大学园林与旅游学院，河北保定 071000； 2.河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北保定 071000)

山丹(Liliumpumilum)花色红艳，观赏价值高，且具有很强的抗寒性和抗镰刀菌性，是优良的野生花卉，在近代百合杂交育种中起到重要作用[1]。20世纪初，俄罗斯就利用西伯利亚寒带地区分布的山丹进行百合的耐寒性育种工作，培育了大量耐低温的百合新品种。杨利平等也曾以山丹为亲本，进行耐寒性百合品种的培育[2-3]。本研究选用山丹与其他百合种或品种进行杂交，并利用荧光观察法[4-6]对其杂交后的花粉生长情况进行观察，为探讨山丹资源在百合远缘杂交中的充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为山丹；野生种有斑百合(L.concolorvar.buschianum)；栽培种兰州百合(L.davidiivar.Unicolor)；切花品种东方百合杂种系列的西伯利亚(Seberia)和索邦(Sorbonne)，亚洲百合杂种系列的精粹(Elite)、托里诺(Torino)，以及麝香百合杂种系列的白天堂(White Heaven)。试验于2017年春天在河北农业大学试验基地进行。

1.2 方法

1.2.1 杂交组合及授粉方法 均以山丹为亲本，分别与其他百合进行正反交(组合见表1)。授粉前的准备及去雄工作参照罗建让的方法[7]。每个组合均采用母本花朵开放当天授粉、延迟授粉(3～4 d)、连续多次授粉、子房基部涂抹萘乙酸(NAA，浓度为0.05%、0.1%)、切割花柱授粉(分不使用NAA和使用0.05% NAA 2个处理)等几种不同授粉处理。每处理个数见结果分析中相应各表。每处理授粉后做好标注，约7 d后除去铝箔纸。统计各处理的坐果率和有胚率。

1.2.2 花粉萌发及生长情况荧光观察 选取山丹的自交组合处理，以及山丹与有斑百合、索邦、西伯利亚的正反杂交处理后的花柱在荧光显微镜下进行观察。花柱及子房的采集、固定、透明软化及染色参照李守丽等的方法[8-9]且有所改动，采集时间为授粉后的1、4、8、12、16、24、36、48、72 h。采用美国Lecia DM4000 B荧光显微镜观察。每处理采集10个样品，试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 杂交试验结果分析

2.1.1 常规授粉对百合杂交结实的影响 当天授粉和延迟授粉是杂交授粉的2种常规方法。由表1可知，以山丹为母本时，当天授粉中坐果率最低是山丹×白天堂，为0，最高是山丹×有斑百合，为58.2%；延迟授粉中山丹×索邦有一定的坐果率，但有胚种子率为0，山丹×西伯利亚坐果率最高，为 53.3%；与当天授粉相比，延迟授粉对大部分杂交组合的坐果率有明显提高(山丹×有斑百合组合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂组合，坐果率由0增至30.0%，有胚种子率增至57.5%。种子有胚率则均是以山丹×西伯利亚组合最高，正交时达到78.6%，反交时则为80.2%。

以山丹为父本时，当天授粉的杂交组合中，有斑百合×山丹的坐果率为20.0%，有胚种子率为12.5%，精粹×山丹的坐果率最高，但其有胚种子率为0；延迟授粉组合中，白天堂×山丹组合的坐果率为20%，种子有胚率最高，达到了68.5%。山丹与兰州百合、西伯利亚和索邦无论当天授粉还是延迟授粉，坐果率均为0；与当天授粉相比，延迟授粉对大部分杂交组合的坐果率和有胚种子率有提高作用。

表1 不同百合杂交组合常规授粉结实情况

注：A表示有斑百合；B表示兰州百合；C表示西伯利亚；D表示索邦；E表示白天堂；F表示精粹；G表示托里诺。下表同。

2.1.2 NAA对百合杂交结实的影响 萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大、增加坐果的作用[10]。NAA的浓度对百合的组合杂交结实有一定的影响，结果见表2。本研究曾在预备试验阶段采用0.2%NAA处理母本花朵子房基部，却使大多数子房变黑，说明选择的NAA浓度过高。与常规杂交当天授粉相比，以山丹为母本时，施用0.05% NAA后，除西伯利亚外，其他几个杂交组合的坐果率均有提高，但有胚种子率却差别不大；施用0.1%NAA时差异最大的是山丹×白天堂组合，不仅坐果率有一定提高，而且有胚种子率达到了45.3%，其他组合反而下降。以山丹为父本时，施用0.1%NAA时，仅有斑百合×山丹的有胚种子率有一定提高，其他无变化，但精粹×山丹的坐果率反而下降。

2.1.3 切割花柱授粉结实情况分析 因为不同百合花柱的长短不同，杂交时常常会由于短花柱父本因其花粉管长度不够而导致杂交不亲和，切割花柱是克服这一障碍的有效方法[11-12]。由表3可以看出切割花柱授粉与常规授粉的差异，以山丹为父本，分别以白天堂、精粹、托里诺为母本的几个组合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里诺为母本的坐果率比延迟授粉时提高了56.2%，切割花柱同时施用 0.05% NAA，坐果率达到了90.0%。但除了以白天堂为母本得到的种子有胚外，其他杂交种子均无胚。

2.2 花粉管萌发荧光观察

2.2.1 山丹自交花粉管萌发荧光观察 山丹自交授粉后，4 h 时在柱头可以看到有少量花粉萌发(图1-a)；至8 h后，能看到大量花粉萌发(图1-b)。山丹自交24 h时，已经有少量花粉管到达花柱基部(图1-c)，并进入子房(图1-d)。48 h时，图1-e显示有大量的花粉管进入子房，72 h时已经伸长至子房基部(图1-f)。

2.2.2 山丹杂交花粉管萌发荧光观察 以山丹和有斑百合互为父母本进行杂交授粉后，均有一定的坐果率和有胚种子率(表1)。以有斑百合为父本，将花粉授于山丹柱头表面后，由图2-a可以看到，4 h时已有大量花粉管萌发；图2-b显示，8 h时已经有大量的花粉管到达花柱的中部；至12 h时，有少量花粉管伸长至花柱底部(图2-c)；24 h时，子房基部已经看到有花粉管(图2-d)。这与山丹自交48 h时相比，时间快了1倍，说明有斑百合的花粉管比山丹的花粉管伸长速度快。

以山丹为父本，将花粉授于有斑百合柱头表面后，由图3-a可以看到，4 h时几乎无花粉萌发；图3b-3f显示，花粉8 h时有少量萌发，24 h时已有大量萌发；12 h时花粉管还没有到达子房上部，24 h时花粉管到达花柱基部，48 h时花粉管已经进入子房。

表2 NAA处理后的结实情况

表3 切割花柱授粉结实情况

对山丹与索邦的正反交组合的荧光观察显示，以索邦为父本时，4 h时花粉已大量萌发(图4-a)，至24 h时，已看到有花粉管到达子房与花柱结合处(图4-c)；以山丹为父本时，8 h时花粉大量萌发(图4-b)，但直至72 h时仍未到达子房(图 4-d)。

山丹与西伯利亚的正反交组合，据荧光观察，以山丹为父本时，分别采用当天和延迟2种方式授粉。由图5-a所示，当天授粉的花粉在12 h有少量萌发，但之后一直未观察到有花粉管继续向下生长的情况。而延迟方法授粉后，4 h时少量花粉萌发，12 h时花粉管已经伸长至花柱9 mm处(图5-b)，但之后的观察也没有发现再继续向下生长的花粉管(图 5-c)。

而以西伯利亚为父本时，无论采用当天或是延迟授粉，4 h 时均观察到已有花粉大量萌发(图5-d)，16 h时能看到花粉管已经伸长至子房(图5-e)，24 h时花粉管已经到达子房底部(图5-f)。

3 讨论与结论

正反交对于植物杂交具有重要影响。杨利平等将细叶百合与雪皇后进行正反交，所得的结实率呈现差异显著，表明在正反组合杂交中父母本的不同，杂交的亲和性以及结实率结果也不同[3]。张西丽等试验证明正反交对杂交结实结果有很大影响[13]，钱灿的研究也得到了相同的结论[14]。孙晓梅等研究表明，母本植物卵细胞中的细胞器和细胞质可能会通过促进或抑制杂交时受精过程，甚至是合子的发育过程，从而影响杂交结果[15]。本试验常规杂交授粉中，山丹作为母本时各杂交组合的坐果率较高，山丹作为父本时，杂交组合多表现为杂交坐果率低甚至为0。延迟授粉对大部分杂交组合的坐果率有明显提高(山丹×有斑百合组合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂组合，坐果率和有胚种子率与当天授粉区别显著。因此，山丹×有斑百合宜当天授粉；山丹与兰州百合、西伯利亚、索邦、白天堂进行杂交时，宜山丹作母本且延迟授粉；山丹与精粹和托里诺的杂交无结实，有待进一步探究。

有研究表明，化学药剂或生长调节剂的应用可提高杂交结实率[16-20]。本研究中，与常规杂交授粉相比，山丹×有斑百合、山丹×兰州百合施用0.05% NAA坐果率更高，山丹×索邦、山丹×白天堂施用0.1% NAA坐果率更高，山丹×西伯利亚施用药剂后，坐果率下降。本研究表明，化学药剂或生长调节剂对杂交结实率有一定的提高，但其也受杂交组合、杂交亲本及药剂浓度的影响，不同的杂交组合的促进作用差异显著，不同浓度药剂对其结实率的影响也较大。

本试验主要以山丹为父本，对其进行切割花柱授粉研究。研究表明，与常规授粉相比，分别以白天堂、精粹、托里诺为母本的几个组合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里诺为母本切割花柱同时施用0.05% NAA的坐果率提高尤为显著。但除了以白天堂为母本得到的种子有胚外，其他杂交种子均无胚。

花朵柱头分泌的黏性物质在促使花粉萌发的同时，还可有效地防止花粉由于干燥而死亡[21-23]。经观察，切花百合西伯利亚、索邦及白天堂在花朵开放的第3、第4天，柱头上明显分泌出大量黏液，山丹在开放第3天柱头较刚开放时湿润，所以延迟授粉对于山丹×西伯利亚及山丹×白天堂、白天堂×山丹组合是克服杂交不孕、提高坐果率的有效方法。西伯利亚作母本时，与山丹杂交，无论采用何种措施，均得不到果实，通过荧光观察发现西伯利亚×山丹组合在当天授粉后有少量花粉萌发，但并没有穿过柱头进入花柱，延迟授粉虽进入花柱，但未发现花粉管继续向下生长。由此推测可能是柱头分泌物抑制了花粉管的伸长生长，或由于胼胝质的不规则堆积、花粉管末端钝化等一系列的异常表现导致的[24-26]。