紫花苜蓿幼苗茎叶响应盐胁迫的双向电泳比较分析

熊军波，刘 洋，田 宏，张鹤山，陈明新

(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球栽培面积最大的多年生豆科牧草，具有高产优质等特性，是公认的“牧草之王”。紫花苜蓿适宜生长在中性偏碱性的土壤环境中，具有中等耐盐碱性，在电导率为0.0～2.0 dS/m的盐碱性土壤中能正常生长，超过此范围，电导率每上升1 dS/m，产量下降7%[1]。根据联合国粮食与农业组织(food and agriculture organization，FAO)的估算，全世界约有3 400万hm2(灌溉面积的11%)受到不同程度的盐渍化影响[2]。据国家农业部组织的第2次全国土壤普查资料统计，我国现有盐渍土的面积为3 467万hm2(不包括滨海滩涂)，其中已开垦种植的为576.8万hm2。如何提高紫花苜蓿在盐碱土壤中的产量，一直是国内外苜蓿工作者关注的重点。

土壤盐碱化是由一系列离子共同构成的，包括NaCl、Na2SO4、MgSO4、CaSO4、MgCl2、KCl和Na2CO3等，NaCl是最主要的盐分构成，目前大部分研究都是围绕NaCl胁迫展开的[3-4]。高浓度的NaCl会引起植物水分缺失、离子毒害、营养失衡、氧化胁迫等，而导致植物生长减缓，甚至死亡[5]。生理生化研究表明，紫花苜蓿通过形态学改变、加强活性氧清除、合成渗透物、离子选择吸收、隔离和外排、改变细胞壁和细胞膜结构等措施以适应盐胁迫[6]。这些适应性调节机制与盐胁迫下紫花苜蓿基因网络的特异性表达密切相关，采用各种高通量技术，已经鉴定出大量盐胁迫响应基因[7-8]。这些研究从转录组水平初步揭示了苜蓿响应盐胁迫的代谢网络，然而基因从转录到最后表达成蛋白行使功能，中间受到复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位、蛋白-蛋白相互作用等调控，因此非常有必要从蛋白质水平进行深入研究。

蛋白质组学从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。近年来，国内外研究者采用蛋白质组学方法对超过34种植物的叶片、根、茎、幼苗、单细胞、种子、子叶下胚轴、花序等组织响应盐胁迫的蛋白质组进行研究，成功鉴定出超过 2 171个盐胁迫响应蛋白质[9]。本研究拟选取耐盐紫花苜蓿品种中苜1号为材料，使用双向电凝胶电泳(2-DE)和质谱鉴定技术对紫花苜蓿幼苗地上部(茎叶)在响应盐诱导时差异表达蛋白进行筛选和鉴定，采用生物信息学方法对差异蛋白的功能和参与的代谢途径进行分析，以期寻找到紫花苜蓿响应盐胁迫应答机制中存在组织异性的调节机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿中苜一号种子由中国农业科学院畜牧研究所牧草研究室提供。挑选籽粒饱满、无病虫害的种子，用1%次氯酸钠溶液消毒5 min，然后用蒸馏水冲洗3次。清洗的种子用蒸馏水浸种12 h后，放置于湿润的滤纸中培养3 d。之后将幼苗移入1/2 Hoagland营养液中进行水培，6 d后开始胁迫。将培养的幼苗分为2组：一组在1/2 Hoagland营养液中培养；另一组在1/2 Hoagland营养液中添加50 mmol/L NaCl适应生长24 h，其后放入浓度为200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液培养。每2 d更换1次培养液，其间不定时搅拌，培养9 d后同时收割2组苜蓿地上部(茎叶)，液氮保存。

1.2 药品与试剂

固相pH值梯度干胶条、IPG缓冲液、双向电泳蛋白洗涤液(2D clean-up)试剂盒、双向电泳蛋白质定量(2D-quant)试剂盒、尿素(urea)、甘氨酸、两性表面活性剂(CHAPS)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(bis-acrylamide)、过硫酸铵(AP)、干胶条覆盖液(矿物油)，均购自Amersham Biosciences；碘乙酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)购自Sigma公司；溴酚蓝、蛋白marker、碳酸钠、乙酸钠、硫代硫酸钠、EDTA二钠盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、低熔点琼脂糖购自BBI(Bio Basic Inc，加拿大)；其他试剂为国产分析纯。所有溶液均用Milli-Q制备的纯水配制。

1.3 总蛋白质的提取和定量

蛋白质提取参照Xiong等的方法[10]，部分进行调整。称取0.5 g样品加入液氮研磨后，转入离心管加入3 mL TRIzol(2% DTT)，振荡混匀，加入0.6 mL三氯甲烷，振荡混匀，放置 5 min；4 ℃、15 000 r/min离心10 min，去上清，添加 0.9 mL 无水乙醇，振荡混匀，放置5 min；4 ℃、15 000 r/min离心5 min，取上清，加入4.5 mL异丙醇，振荡混匀，4 ℃放置5 min；此后4 ℃、15 000 r/min离心10 min，去上清，用6 mL含 300 mmol/L 盐酸胍的95%乙醇洗涤沉淀3次；4 ℃、15 000 r/min 离心10 min，留沉淀，用6 mL无水乙醇洗涤1次，冷冻干燥。其后加入裂解液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG缓冲液(pH值为4～7)和0.02 mg/mL溴酚蓝，超声20 min促溶，4 ℃静置4 h以上，离心沉淀(4 ℃、40 000 r/min)1 h，吸取上清备用。使用2D-quant试剂盒对蛋白质进行定量分析，步骤按试剂盒说明进行。

1.4 等电聚焦电泳和SDS-PAGE电泳

使用水化液[8 mol/L尿素、20 mg/mL CHAPS、10 mg/mL DTT、0.5% IPG缓冲液(pH值4～7)和0.02 mg/mL溴酚蓝]稀释蛋白质溶液，最终将0.27 mg/mL蛋白质溶液上样到 24 cm、pH值4～7的IPG胶条上。等电聚焦在Ettan IPGphor Ⅱ(GE Healthcare)仪器上进行，温度设置为20 ℃，程序为：30 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000～40 000 V·h。等电聚焦后胶条立即平衡，首先在含有平衡液[6 mol/L尿素、300 mg/mL甘油、20 mg/mL SDS、50 mmol/L Tris-HCl，pH值8.8，10 mg/mL DTT]的平衡液管中水平放置15 min，其后换入含有平衡液的管中水平放置 15 min。平衡后的胶条转移到12% SDS-PAGE凝胶中进行二向分离，首先在电泳液(250 mmol/L Tris-base、1.92 mol/L甘氨酸和 10 mg/mL SDS)中0.2 W/胶条运行1 h，其后相同环境中使用15 W/胶条运行到结束。每组试验设置4次组内重复。

1.5 蛋白染色和图像分析

凝胶选用银染，方法参照GE handbook作适当修改。凝胶首先在含有40%乙醇、10%乙酸的水溶液中固定1 h，其后使用含有30%乙醇、2 mg/mL硫代硫酸钠和6.8%乙酸钠溶液中敏化30 min。经超纯水漂洗3次，每次5 min；后转入含有2.5 g/L硝酸银溶液中银染20 min，其后使用超纯水漂洗2次，每次1 min；转入显色液(25 g/L碳酸钠、240 mL/L 甲醛)中显色2次：第1次1 min，第2次4 min。反应完后转入含有1.46% EDTA的溶液中10 min终止反应，最后使用纯水漂洗3次，每次5 min。染色完成的胶用Powerlook 2100XL扫描仪扫描，并使用ImageMasterTM2D Platinum 6.0软件分析，包括凝胶图像的背景消除、点确认、定量和点的匹配等，选取蛋白质相对表达量差异达2倍以上的蛋白质点进行质谱分析。

1.6 蛋白质谱鉴定

根据ImageMaste分析软件结果挖取差异蛋白质点，委托华大基因进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析。将所得到的肽片段质量数据运用MASCOT软件进行在线检索(http：//www.matrixscience.com)，选取NCBI数据库作为检索数据库。鉴定成功的蛋白质点根据aimGo数据库(http：// www.geneontology.org/)功能注释进行分类统计。

2 结果与分析

2.1 双向电泳凝胶图谱分析和质谱鉴定

分别提取对照组和处理组地上部分蛋白质进行双向电泳，电泳图谱见图1。基于ImageMaster图像软件分析，每张 2-DE胶上约可检测到900多个蛋白质点，其中对组照凝胶上(0 mmol/L NaCl)凝胶上有(907±31)个蛋白质点，而处理组(200 mmol/L NaCl)凝胶上有(914±23)个蛋白质点，2个试验组内变异系数都在5%以内。对其蛋白质点分布分析表明，大多数蛋白质点集中在等电点为5～7，分子量为38～90 ku。软件匹配和手工匹配相结合，2种处理的蛋白质匹配成对的有817对。丰度分析表明，有20个蛋白质点相对丰度发生2倍以上变化，可以重复，蛋白质点轮廓清晰可见，同时在分析时去掉了可能的生物学影响及胶本身的影响。其中13个在盐胁迫下表达量下调，7个表达量上调。差异表达蛋白质点广泛分布于双向图谱中，部分蛋白质点局部见图2。

2.2 差异表达蛋白的质谱分析和功能分类

选取全部差异表达蛋白进行MALDI-TOF-TOF/MS分析，Mascot软件搜索NCBInr和SWISSPROT数据库GreenPlants进行匹配，14个匹配成功(表1)。基于aimGo数据库功能注释，将这些蛋白的功能分为以下几类：Ⅰ类，参与光合作用蛋白。共4个蛋白质，包括1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(编号4)、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(编号3)、苯醌质体蓝素还原酶(编号13)、叶绿体放氧增强蛋白1(OEE1，编号5)。Ⅱ类，胁迫防御类蛋白。共2个蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶1(编号9)和抗病相关蛋白2(编号7)。Ⅲ类，碳水化合物代谢相关蛋白。共2个蛋白，包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(编号12)和蔗糖合酶(编号1)。Ⅳ类，转录调控和信号传导相关蛋白。共2个蛋白，包括液泡的钙结合相关蛋白(编号14)和真核翻译起始因子5A-2(编号8)。Ⅴ类，生长发育调控蛋白。共2个蛋白，包括细胞分裂周期蛋白48(编号11)和F-box家族蛋白(编号10)。Ⅵ类，次生代谢相关蛋白。共2个蛋白，包括硫腺苷甲硫氨酸和酶(编号6)和丙二烯氧化环化酶2(编号2)。

表1 盐胁迫下紫花苜蓿差异表达蛋白的串联质谱鉴定结果

续表1

编号匹配蛋白名称(物种)NCBI登录号理论分子量Ku/等电点测定分子量Ku/等电点得分匹配肽段数(个)相对表达量7抗病相关蛋白2(PR2)[紫花苜蓿]2226600116.5/5.836/6.834448真核翻译起始因子5A-2(eIF-5A-2)[海岛棉]4564451017.2/5.235/4.5112311细胞分裂周期蛋白48(CDC48)[拟南芥]184149390.6/5.034/4.940761蔗糖合酶(SS)[紫花苜蓿]316954492.6/5.820/4.375310F-box家族蛋白[拟南芥]1523626658.2/9.6886.0984

注：“相对浓度”一栏中，1表示对照，2表示处理。

3 讨论

3.1 光合作用和碳水化合物代谢相关蛋白质

盐胁迫下，植物的光合作用首先受到影响[11]。在鉴定的差异表达蛋白中有4个蛋白参与到光合作用过程中，其中苯醌质体蓝素还原酶(PPR)和放氧增强蛋白1(OEE1)参与光合作用中的光反应阶段。OEE1是光系统Ⅱ(PSⅡ)中放氧复合体的2个亚基之一，靠近类囊体腔的一侧，参与水的裂解和氧的释放[12]。体外试验也证实了OEE1能催化水氧化为氧分子，且当OEE1表达量下降时，PSⅡ的活性下降16%～40%[13]。PPR参与质体蓝素的合成，质体蓝素为细胞色素复合体与PSⅠ之间的电子传递中介受体[14]。在本研究中2个光反应相关蛋白表达量下降，必将导致光反应向暗反应提供能量的减少。研究还发现，暗反应关键调节酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)大小2个亚基表达量发生变化。RuBisCO催化暗反应的碳固定，将大气中游离的CO2转化为生物体内储能分子，同时也是光呼吸催化酶。高等植物中RuBisCO是由8个大亚基和8小亚基组成的寡聚体，在植物叶片内的含量很高，约占可溶性蛋白质的50%以上[15]。有研究表明，RuBisCO亚基表达量改变与活性氧导致的RuBisCO的降解相关[16]。

盐胁迫下，植物水分吸收受阻，为了减少水分蒸发，植物通过减小叶片面积、关闭气孔以适应盐胁迫环境。叶片面积减少会导致光反应速率受到影响，在本研究中鉴定的光反应相关蛋白表达量下降，与这些生理现象相关。同时，气孔的闭合将直接导致CO2的吸收和同化减少，RuBisCO的降解必然会导致碳素化合物合成减少，而对后续的碳水化合物正常生理代谢产生影响。在本研究中发现蔗糖合成酶(SS)与甘油醛-3-磷酸酶(GAPDH)2个参与碳水化合物代谢的酶表达量下降。其中，SS是植物体内蔗糖合成和分解的关键酶，直接调控蔗糖在由“源”向“库”的运输，同时也是蔗糖进入各种代谢途径的关键酶[17-18]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是高等植物糖酵解、糖异生和卡尔文循环过程中的关键酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反应，是糖酵解(糖异生)中唯一的氧化(还原)反应，催化依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)，将3-磷酸甘油醛氧化为3-磷酸甘油酸，同时伴有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)生成的不可逆反应[19]。这2个蛋白质表达量的下降，进一步表明盐胁迫对碳水化合物的合成代谢产生影响。

3.2 胁迫防御蛋白相关蛋白质

当植物在受到真菌、细菌和病毒等病原体入侵或受到非生物胁迫时会产生和积累病程相关(PR)蛋白，PR蛋白的诱导已在多种植物中发现，它是植物自我防御机制中的可诱导组分。PR蛋白根据其作用和功能分为17个家族，其中PR2蛋白属于β-1，3-葡聚糖酶家族，其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的细胞壁，参与植物生长发育的各个阶段的调控[25]。在本研究中盐胁迫下茎叶中PR2蛋白表达量上升，在此前的研究中还未发现该蛋白响应盐胁迫的诱导。

3.3 次生代谢相关蛋白质

本研究中鉴定出5-腺苷甲硫氯酸合成酶(SAMS)和丙二烯氧化环化酶2(AOC2) 2个参与到激素合成次生代谢蛋白表达量发生改变。其中，SAMS参与催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的生物合成，而SAM是植物体内一个普遍的甲基供体，也是乙烯生物合成的前体。对SAMS的研究表明其在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代谢及其调控研究上均具有重要的意义。在本研究中SAMS蛋白质表达量下降，这与此前在拟南芥根中的研究结果[26]一致。丙二烯氧化环化酶2(AOC2)是茉莉酸(jasmonic acid，JA)合成前体，植物JA作为一种信号分子，参与诱导气孔关闭，抑制Rubisco生物合成，影响植物对N、P的吸收，葡萄糖等有机物的运输以及生物胁迫的应急反应调控等[27]。对AOC基因功能研究表明，在番茄中转入外源的AOC能提高其抗盐碱能力[28]。此前研究还表明，在盐胁迫条件下，该蛋白质在耐盐植物盐芥中表达量上升，而在敏盐植物拟南芥中表达量下降，表明该蛋白质的表达量可能与耐盐调节相关[29-30]。在本研究中AOC2蛋白质表达量上升，可能对紫花苜蓿耐盐调节有重要作用。

3.4 转录调控和信号传导相关蛋白质

植物感受到外界环境刺激，通过特定的受体将这一信号传递到细胞核，并诱导相关基因的表达来适应外界环境，此过程受到复杂的转录、翻译和剪切修饰等调控。Ca2+是植物体内重要的信号分子，在受到多种胁迫时都会诱导细胞基质中钙离子浓度变化(Δ[Ca2+]cyt)，特定的膜联蛋白质(annexins)通过结合Δ[Ca2+]cyt而进行信息传递[31]。Δ[Ca2+]cyt浓度的增加被一种钙依赖磷酸酶(calcineurin B-like protein CBL4)所感应，通过磷酸化激活特定的蛋白质，从而启动到后续调节反应。此后，[Ca2+]cyt由通过Ca2+通道、Ca2+结合蛋白对钙的缓冲等降低细胞基质中Ca2+含量。在本研究中液泡钙离子结合相关蛋白质(vacuolar calcium-binding protein-related)在Ca2+通道中起到缓冲[Ca2+]cyt的作用，在盐胁迫下表达量上调。

eIF-5A为真核细胞蛋白转译起始因子，普遍存在于真核生物和原始细菌中。研究表明，它是目前自然界中唯一一种含有特殊氨基酸8-羟基2,7,10-三氨基癸酸(hypusine)的蛋白质，eIF-5A只有通过hypusine化修饰后才能行使其功能，与经典的转录起始因子不同的是，eIF-5A并非所有蛋白质翻译所必需的因子[32]。研究还证实，eIF-5A与细胞中的许多生命活动有关，如细胞增殖、蛋白质翻译、mRNA降解、细胞周期的转化及细胞衰老与凋亡等[33]。对拟南芥eIF-5A家族成员的分析表明，不同家族成员参与的转录调控与植物的不同生理防御相关，其中eIF-5A-2参与拟南芥受到病毒感染和伤害后的信号传导，并通过细胞分裂素信号通路调控拟南芥根木质部的发育，在细胞的分裂、生长和死亡中发挥着重要作用[34]。本研究中eIF-5A-2表达量下降，表明该蛋白质也参与到盐胁迫调节中。

3.5 生长发育调控相关蛋白质

泛素-蛋白酶途径在细胞周期控制、昼夜节律、花的发育和激素信号转导等许多细胞过程中都发挥着关键作用。在该途径中，泛素标记单细胞发育过程中不需要的蛋白质被蛋白酶26S降解，从而调控细胞的发育和分化[35]。本研究盐胁迫下，茎叶中1个F-box家族蛋白和1个细胞分化周期蛋白质表达量都下降，且都与泛素-蛋白酶途径相关。F-box家族蛋白质通过与Skp1p-cullin结合形成Skp1p-cullin-Fbox (SCF)蛋白质复合体，该复合体蛋白质能识别目标降解蛋白质，从而调控细胞分化、细胞周期、转录调控和信号传导等过程[36]。在植物体中，CDC48蛋白质参与纺锤体的分解、泛素结合蛋白质的分解和蛋白质从内质网膜到细胞质的运输[37-38]。盐胁迫下，苜蓿的生长发育减缓，这2个蛋白质表达量的下降也反映了该生理过程。

4 结论

差异蛋白质组学通过比较植株细胞在不同生理调节下蛋白质的差异表达，对相关蛋白质进行鉴定和分析，从蛋白质组学水平揭示植物在适应胁迫环境中的调节机制。本研究将差异蛋白质组学技术运用于紫花苜蓿盐胁迫适应机制的研究中，分别提取对照和盐胁迫环境中紫花苜蓿地上部蛋白质，应用双向电泳技术进行分离，通过双向电泳太图谱分析软件分析，获得图谱中20个点丰度发生2倍以上变化，采用串联质谱成功鉴定出14个差异表达蛋白质，应用生物信息学方法并结合植物生理学，对这些差异蛋白所参与的代谢途径及其作用机理进行分析。结果表明，这些蛋白质主要参与光合作用、胁迫防御应答、碳水化合物代谢、转录调控和信号传导、细胞分化和次生代谢。