板栗叶片解剖结构特征及其与抗旱性的关系

郭素娟，武燕奇

(北京林业大学 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京100083)

干旱是限制植物正常生长发育的主要因子之一[1]。随全球气候变化，干旱越来越成为制约世界各国农林业发展的重要因素[2]。叶片控制植物光合作用、水分蒸腾、气体交换等生理活动，对植物的正常生长发育至关重要，因其长期暴露于自然环境中，因此对环境产生了一定的适应性[3-4]。干旱条件下，植物叶片的形态及解剖结构均会发生一系列变化，这些变化有利于提高其对水分的利用效率，从而适应干旱环境。

近年来，许多学者运用多元统计分析方法对叶片形态及解剖结构与抗旱性的关系进行了研究[5]。如潘昕等[6]利用石蜡切片法对青藏高原25种灌木的抗旱性进行了评价。翟晓巧等[7]利用扫描电镜法对8种落叶乔木的抗旱性进行了研究。张义等[8]利用石蜡切片法及指甲油印迹法对西宁市11种城市森林植物的抗旱性进行了评价。植物叶片包括上(下)表皮、栅栏组织、海绵组织、气孔等结构。相关研究表明，气孔密度、叶片厚度、栅栏组织厚度、紧密度等与抗旱性呈正相关关系；气孔大小、气孔开张度、海绵组织厚度、疏松度等与抗旱性呈负相关关系[9-12]。

板栗(CastaneamollissimaBl.)是重要经济林树种之一，其坚果食用部分富含碳水化合物，并有蛋白质、脂肪、矿物质等多种营养成分，是我国重要的木本粮食物种，被誉为“铁杆庄稼”，具有分布范围广、适应能力强、果实品质优良、综合利用价值高等特性，在国际市场上占有重要地位。目前有关板栗抗旱性的研究多集中于生理指标方面，如李钧[13]研究了水分胁迫后板栗苗木丙二醛、脯胺酸、保护酶活性的变化；时忠杰等[14]、郑龙等[15]、武燕奇等[16]以板栗苗木为对象，研究了MDA含量、SOD和POD活性、电导率等生理指标及根系形态指标对干旱胁迫的响应情况。而关于板栗叶片解剖结构特征及其与抗旱性关系的研究报道较少。为此，本研究以河北省迁西县10个板栗品种(系)为试验材料，分析其叶片解剖结构及气孔特征，综合评价其抗旱性，以期为迁西地区抗旱板栗品种(系)的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于河北省迁西县北京林业大学经济林(板栗)育种与栽培实践基地，地处118°06′-118° 37′E，39°57′-40° 27′N，属暖温带大陆性半湿润季风气候。试验地年平均降水量804.2 mm，年最大降水量1 066.4 mm，年最小降水量428.4 mm；年平均气温10.1 ℃，7月份平均气温25 ℃，1 月份平均气温-7.8 ℃；无霜期一般为183 d。

1.2 试验材料

在试验地选取长势良好、一致的大板红(DBH)、燕龙(YL)、紫晶(ZJ)、迁西早红(QXZH)、燕山短枝(YSDZ)、燕山早丰(YSZF)、紫珀(ZP)、燕奎(YK)、迁西晚红(QXWH)和迁西壮栗(QXZL)等10个板栗品种(系)的7年生植株用于试验。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 叶片解剖结构 于2015年8月，对10个供试板栗品种(系)进行取样。每品种(系)选取10株，取树冠中上部向阳处的功能叶30片进行试验。选择晴天上午09:00-11:00进行取样，以便于气孔结构的观察。于叶片主脉两侧剪取0.5 cm×0.5 cm的小方块，立即用FAA固定液固定，采用常规石蜡切片法[17]制作石蜡切片，每品种(系)20个重复。切片在Olympus DP72显微镜下进行观察，并用Motic Image Advanced 3.0软件对叶片厚度(X1)、上表皮角质层厚度(X2)、上表皮厚度(X3)、下表皮厚度(X4)、下表皮角质层厚度(X5)、栅栏组织厚度(X6)、海绵组织厚度(X7)等指标进行测量，每个视野重复30 次，并按照下列公式计算相关指标：

栅海比(X8)=栅栏组织厚度/海绵组织厚度。

叶片栅栏组织结构紧密度(X9)=栅栏组织厚度/叶片厚度×100%。

叶片海绵组织结构疏松度(X10)=海绵组织厚度/叶片厚度×100%。

1.3.2 气孔特征 采样及固定方法同1.3.1。采用指甲油印迹法[8]，先用橡皮将板栗叶片背面的星状毛擦掉，涂一层透明指甲油，待其完全晾干后，用透明胶带粘下一块下表皮，置于载玻片上，每品种(系)20个重复，在Olympus DP72显微镜下进行观察，并用Motic Image Advanced 3.0软件对气孔长度(X11)、气孔宽度(X12)、气孔开张宽度(X13)、气孔开张长度(X14)、气孔密度(X15)等指标进行测量，每个视野重复30次。

1.3.3 数据处理 采用Excel和SPSS进行数据处理。利用主成分法、隶属函数法、聚类分析法对各品种(系)抗旱性进行研究。

采用主成分分析法确定各指标的权重，加权求和得出板栗不同品种(系)抗旱性度量值(D)[16,18]，再根据10个品种(系)板栗的D值进行聚类分析。D计算公式为：

式中：R(Xij)表示i品种(系)j指标的隶属函数值，Wj为指标j的权重。R(Xij)的计算公式[12]为：

R(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

如某一指标与抗旱性为负相关，则：

R(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Xij表示i品种(系)j指标的测定值,Xmax及Xmin分别表示j指标的最大值及最小值。

2 结果与分析

2.1 不同品种(系)板栗叶片解剖结构特征的比较

植物叶片由于长期暴露在自然环境中，因此形态结构特征可以反映其对环境的适应性[5]。小而厚的叶片可以提高保水力，减少蒸腾面积。叶片上、下表皮可以起到减少水分蒸发的作用，上、下表皮越厚，则抗旱性越强。由表1可知，10个板栗品种(系)中，燕奎的叶片最厚(210.65 μm)，燕龙最薄(129.92 μm)；紫珀、大板红、燕奎、迁西早红、迁西晚红之间及紫晶、燕山早丰、燕山短枝之间叶片厚度差异不显著(P>0.05)，但均显著大于迁西壮栗(P<0.05)，迁西壮栗显著大于燕龙(P<0.05)。燕龙的上表皮角质层最厚(12.61 μm)，迁西早红最薄(4.70 μm)；紫晶、大板红、燕龙之间及燕奎、燕山早丰、燕山短枝、迁西早红、迁西晚红、迁西壮栗之间上表皮角质层厚度差异不显著(P>0.05)，且以前面几个品种较厚。大板红的上表皮最厚(31.36 μm)，燕山早丰最薄(18.48 μm)，二者差异显著(P<0.05)，其他品种间均无显著差异。燕山早丰下表皮最厚(13.08 μm)，大板红最薄(6.89 μm)，其他品种(系)间基本无显著差异。燕山早丰的下表皮角质层最厚(4.61 μm)，紫珀最薄(1.60 μm)，其他品种(系)间基本无显著差异。

叶片栅栏组织中细胞排列紧密，可以减少水分蒸发，提高光合效率，进而增加植物的抗旱能力。海绵组织中细胞排列疏松，不利于水分的保持，影响植株的抗旱能力。叶片栅栏组织结构紧密度和海绵组织结构疏松度分别反映栅栏组织、海绵组织占叶片厚度的比例，可以表征抗旱性。由表1可知，在10个板栗品种(系)中，燕奎的栅栏组织厚度最厚(103.78 μm)，迁西壮栗最薄(40.67 μm)；紫晶、紫珀、大板红、燕龙、燕奎、燕山短枝、迁西早红之间及迁西晚红、迁西壮栗之间栅栏组织厚度差异不显著(P>0.05)，且前者显著大于后者(P<0.05)。迁西晚红的海绵组织最厚(117.24 μm)，紫晶最薄(51.52 μm)；紫珀、燕奎、燕山早丰、迁西早红、迁西壮栗的海绵组织厚度显著大于紫晶(P<0.05)，但显著小于迁西晚红(P<0.05)。紫晶的栅海比最大(1.84)，显著大于其他品种(P<0.05)，迁西壮栗的最小(0.42)；大板红、燕龙、燕奎、燕山短枝之间及迁西晚红、迁西壮栗之间栅海比差异不显著(P>0.05)。燕龙叶片的栅栏组织结构紧密度最大(0.62)，显著高于其他品种(系)，迁西晚红最小(0.25)；紫晶、大板红、燕奎、燕山短枝之间及迁西晚红、迁西壮栗之间栅栏组织结构紧密度差异不显著(P>0.05)。迁西晚红叶片的海绵组织结构疏松度最大(0.60)，紫晶最小(0.30)；紫晶、大板红、燕山短枝之间差异不显著(P>0.05)，但显著低于其他品种(P<0.05)；迁西晚红、迁西壮栗之间差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他品种(P<0.05)。

表1 10个品种(系)板栗叶片的解剖结构特征Table 1 Leaf anatomical structure characteristics of ten varieties (clones) of Chinese chestnut

注：X1.叶片厚度；X2.上表皮角质层厚度；X3.上表皮厚度；X4.下表皮厚度；X5.下表皮角质层厚度；X6.栅栏组织厚度；X7.海绵组织厚度；X8.栅海比；X9.叶片栅栏组织结构紧密度；X10.叶片海绵组织结构疏松度。同列数据后标不同小写字母表示在P=0.05水平存在显著性差异(Duncan’s法)。下表同。
Note:X1.Thickness of leaves；X2.Cuticle thickness of upper epidermis；X3.Thickness of upper epidermis；X4.Thickness of lower epidermis；X5.Cuticle thickness of lower epidermis；X6.Thickness of palisade tissue；X7.Thickness of spongy tissue；X8.Ratio of palisade tissue to spongy tissue；X9.Leaves compactness；X10.Leaves compactness and porosity.Different lowercase letters in each column mean significant difference atP=0.05 level (Duncan’s).The same below.

2.2 不同板栗品种(系)叶片气孔特征的比较

叶片上气孔的大小、密度及开张程度影响水分的蒸腾速率，气孔小而密且开张程度较小可以减少水分蒸腾耗散，提高其抗旱性。由表2可知，10个板栗品种(系)中，迁西早红叶片气孔长度最大(24.28 μm)，燕龙最小(18.17 μm)，二者差异显著(P<0.05)。大板红的叶片气孔宽度最大(20.90 μm)，燕龙最小(16.59 μm)，显著小于除紫晶、燕奎外的其他品种(P<0.05)。紫晶的叶片气孔开张宽度最大(7.74 μm)，迁西晚红最小(2.39 μm)；紫晶、迁西早红之间差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他品种(P<0.05)。10个板栗品种(系)的叶片气孔开张长度差异不显著(P>0.05)，以燕山早丰最大(13.00 μm)，迁西晚红最小(10.17 μm)。燕山早丰的叶片气孔密度最大(1 000.73 mm-2)，迁西壮栗最小(648.48 mm-2)；紫晶、大板红、燕奎、燕山短枝、迁西早红、迁西晚红之间差异不显著(P>0.05)，紫珀、迁西壮栗之间差异不显著(P>0.05)。

2.3 板栗抗旱指标权重的确定

10个板栗品种(系)所测15项指标之间存在一定的相关关系，反映的信息有一定重叠，不能直接用来分析抗旱性。因此，本试验通过主成分分析确定15项指标反映抗旱性时所占的权重，结果见表3。由表3可知，第1主成分贡献率为40.41%，其中上表皮角质层厚度、上表皮厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅海比、叶片栅栏组织结构紧密度、叶片海绵组织结构疏松度、下表皮厚度等在第1主成分上载荷较高，表明上表皮角质层、上表皮、栅栏组织越厚，栅海比、叶片栅栏组织结构紧密度越大，叶片海绵组织结构疏松度越小，板栗抗旱性越强。第2主成分贡献率为17.58%，其中叶片厚度、气孔密度在第2主成分上载荷较高，表明叶片越厚，气孔密度越大，抗旱能力越强。第3主成分贡献率为16.13%，其中气孔长度、气孔开张长度在第3主成分上载荷较高。第4主成分贡献率为11.06%，下表皮角质层厚度、气孔宽度、气孔开张宽度在第4主成分上载荷较高。气孔是植物吸收CO2、散失水分的通道，气孔大小、气孔开张度与抗旱性存在一定关系。第5主成分贡献率为8.06%，叶片厚度在第5主成分上载荷较高。5个主成分贡献率累计达到93.25%，与抗旱能力相关性大，因此提取前5个主成分分析板栗的抗旱性。

表2 10个品种(系)板栗叶片的气孔特征Table 2 Leaf stomatal structure characteristics of varieties(clones)of ten Chinese chestnut

注：X11.气孔长度；X12.气孔宽度；X13.气孔开张宽度；X14.气孔开张长度；X15.气孔密度。
Note:X11.Stomatal length；X12.Stomatal width；X13.Stomatal aperture width；X14.Stomatal aperture length；X15.Stomatal density.

表3 10个板栗品种(系)15项指标的主成分分析Table 3 Principal component analysis of 15 indexes of ten varieties (clones) of Chinese chestnut

注：X1～X15所代表的指标与表1和表2相同。表4同。
Note:The indexes ofX1-X15are the same as Table 1,Table 2,and Table 4.

根据主成分载荷矩阵求得主成分F1、F2、F3、F4、F5的表达式分别为：

F1=-0.04X1+0.29X2+0.24X3-0.29X4-0.08X5+0.34X6-0.35X7+0.39X8+0.39X9-0.33X10-0.19X11-0.19X12+0.18X13-0.04X14+0.09X15。

F2=0.44X1-0.29X2+0.26X3-0.03X4-0.29X5+0.21X6+0.11X8-0.10X9-0.26X10+0.35X11+0.31X12+0.02X13-0.13X14-0.44X15。

F3=-0.08X1-0.23X2-0.16X3+0.27X4+0.28X5+0.08X6-0.23X7+0.11X8+0.10X9-0.18X10+0.38X11+0.17X12+0.31X13+0.59X14+0.20X15。

F4=0.24X1+0.02X2+0.16X3-0.17X4+0.51X5+0.12X6+0.04X7+0.04X8+0.02X9-0.12X10+0.40X12-0.51X13-0.12X14+0.41X15。

F5=0.55X1-0.24X2-0.44X3+0.15X4+0.09X5+0.31X6+0.24X7+0.06X8+0.04X9-0.10X10-0.24X11-0.39X12+0.09X13-0.08X14+0.15X15。

根据5个主成分的权重，求得主成分F的表达式为：

F=(λ1F1+λ2F2+λ3F3+λ4F4+λ5F5)/(λ1+λ2+λ3+λ4+λ5)。

式中：λ1、λ2、λ3、λ4、λ5分别为5个主成分的特征根。

即：

F=0.13X1+0.01X2+0.11X3-0.09X4+0.03X5+0.24X6-0.17X7+0.22X8+0.17X9-0.25X10+0.03X11+0.02X12+0.08X13+0.04X14+0.05X15。

上述表达式中，指标前数值越大，表示权重越大，越能反映板栗抗旱性。由此可知，15项指标反映板栗抗旱性能力的顺序为：叶片海绵组织结构疏松度(0.25)>栅栏组织厚度(0.24)>栅海比(0.22)>叶片栅栏组织结构紧密度(0.17)>海绵组织厚度(0.17)>叶片厚度(0.13)>上表皮厚度(0.11)>下表皮厚度(0.09)>气孔开张宽度(0.08)>气孔密度(0.05)>气孔开张长度(0.04)>气孔长度(0.03)=下表皮角质层厚度(0.03)>气孔宽度(0.02)>上表皮角质层厚度(0.01)。

2.4 10个板栗品种(系)抗旱性的隶属函数分析及综合评价

根据隶属函数法，求得10个板栗品种(系)不同指标的隶属函数值，结合主成分分析法求出的各指标权重，综合计算抗旱性度量值(表4)，据此对抗旱性进行排序。由表4可知，抗旱性度量值最大的品种为大板红(1.27)，最小的为迁西壮栗(0.36)。10个板栗品种(系)的抗旱性排序为：大板红(1.27)>紫晶(1.24)>燕龙(1.13)>燕奎(1.13)>燕山短枝(0.94)>燕山早丰(0.94)>紫珀(0.90)>迁西晚红(0.84)>迁西早红(0.44)>迁西壮栗(0.36)。

表4 10个品种(系)板栗抗旱性的隶属函数值和抗旱性度量值(D)Table 4 Subjection function values, index weights and drought resistance values(D) of ten varieties(clones)of Chinese chestnut

2.5 10个板栗品种(系)抗旱性的聚类分析

依据板栗的抗旱性度量值，对10个品种(系)进行聚类分析，结果如图1所示。由图1可知，10个板栗品种(系)按抗旱性强弱可以分为3类，其中第1类抗旱性强，品种(系)有紫晶、大板红、燕龙、燕奎；第2类抗旱性中等，品种(系)有紫珀、燕山短枝、燕山早丰、迁西晚红；第3类抗旱性较弱，品种(系)有迁西早红、迁西壮栗。

图1 10个板栗品种(系)抗旱性的聚类分析Fig.1 Clustering analysis on drought stress resistance of ten Chinese chestnut varieties (clones)

3 讨论与结论

叶片的形态及解剖结构是叶片与环境条件长期作用的结果[19]，其可较好地反映植物对干旱等逆境条件的适应性。相关研究表明，较厚的叶片有利于水分的保存，因此抗旱性较强[20]。刘捷平[21]、薛智德等[22]认为，叶片角质层可以减少水分的蒸发，增加对光照的折射率，起到一定的抗旱作用。刘红茹等[23]发现，叶片表皮越厚，越不利于水分散失，植物抗旱性越强。徐扬等[24]认为，叶片栅栏组织的紧密结构，有利于水分的储存，且其中含有大量的叶绿体，有利于光合作用的进行，因而栅栏组织越发达，植株的抗旱性越强；海绵组织中结构疏松，有利于水分散失；植物叶片栅栏组织结构紧密度越大或叶片海绵组织结构疏松度越小，则栅栏组织所占的比例越大，植株越抗旱。本研究中，10个板栗品种(系)抗旱机制不同，其中紫晶通过提高栅栏组织与海绵组织的比值来抵御干旱环境；大板红通过增加叶片上表皮及栅栏组织厚度来提高抗旱性；燕龙通过增加叶片角质层厚度及叶片中栅栏组织结构紧密度来抵御旱害；燕奎通过增加叶片厚度及栅栏组织厚度来提高抗旱性；燕山早丰通过增加下表皮及下角质层厚度来抵御干旱。

相关研究表明，气孔小而多者，抗旱性强，这是因为一方面水分充足时可以提高光合效率，另一方面水分缺乏时可以减少水分散失[7,11,25-26]。但也有学者认为，气孔少，反而抗旱性弱，因为气孔密度与气体交换阻力成反比，气孔密度小，气体交换阻力增大，蒸腾作用减小[27]。本研究结果表明，抗旱性较强的燕龙叶片表皮气孔长度、宽度较小，而抗旱性较差的迁西早红、迁西壮栗叶片表皮气孔长度较大，抗旱性较强的紫晶气孔开张宽度最大，这可能是因为不同品种(系)在干旱环境中采取的抗旱机制不同。结合叶片解剖结构发现，燕龙上表皮角质层较厚，气孔较小而密度较大，说明其抗旱机制除了增加叶片角质层厚度及叶片中栅栏组织比例外，还包括控制气孔大小和密度；燕奎叶片厚度、栅栏组织较厚，气孔较小，说明其除了增加叶片厚度及栅栏组织厚度外，也通过控制气孔大小来抵御干旱；燕山早丰下表皮及下表皮角质层较厚，气孔密度最大，说明其除了增加表皮及角质层厚度外，也通过控制气孔密度来抵御干旱。

10个板栗品种(系)叶片各项指标的大小顺序并不一致，可见在研究抗旱性时，不能单凭某一项指标来进行评价[27-31]。因此，采用基于多项指标的隶属函数法进行抗旱性研究具有一定的可行性。同时，根据主成分分析确定各指标的权重，可提高抗旱性评价的准确性。本试验通过分析得出，所选择的15项指标反映抗旱性的能力并不相同，从大到小的顺序为：叶片海绵组织结构疏松度、栅栏组织厚度、栅海比、叶片栅栏组织结构紧密度、海绵组织厚度、叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、气孔开张宽度、气孔密度、气孔开张长度、气孔长度、下表皮角质层厚度、气孔宽度、上表皮角质层厚度。聚类分析表明，10个板栗品种(系)可分为3个类型，抗旱性强者为紫晶、大板红、燕龙、燕奎；抗旱性中的为紫珀、燕山短枝、燕山早丰、迁西晚红；抗旱性弱的为迁西早红、迁西壮栗。

综上所述，叶片解剖结构指标能较好地反映板栗的抗旱特性，可用于板栗抗旱性的鉴定与评价。本研究选择的10个板栗品种(系)中，紫晶、大板红、燕龙、燕奎的抗旱性最强，可在迁西地区广泛种植。