红景天植物石蜡切片的制作和结构观察研究

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(1.成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106；2.成都大学 四川抗菌素工业研究所, 四川 成都 610052)

红景天为景天科红景天属多年生草本植物，其根茎和根是一种较为稀缺的中药材[1]。现代药理学研究表明，红景天药材具有抗缺氧、抗氧化、抗微波辐射、抗衰老、抗心律失常以及治疗高原红细胞增多症的功效，另外还有抗病毒、抗癌和保肝等方面作用[2-4]；目前研究还发现，红景天植物中所含有的红景天苷不仅能有效地抑制 SH-SY 5 Y 细胞凋亡,还可对神经细胞起到保护作用[5]。

红景天植物在我国有73种2亚种7变种，大多生长于高寒、缺氧和紫外线照射强、昼夜温差大、海拔2 000～5 000 m的岩石缝隙和高山砾石中[6]；红景天植物既是重要的中药材来源植物，又是治理土壤沙漠化的重要经济树种[7]。

本实验选择大花红景天、长鞭红景天和狭叶红景天的根与根状茎为材料，研究了3种红景天植物的石蜡切片制作方法，并进一步比较了3种红景天植物石蜡切片的显微组织结构特点。

1 材料、仪器和试剂

1.1 材 料

实验材料狭叶红景天、大花红景天和长鞭红景天取自阿坝藏族羌族自治州红原县。

1.2 试验仪器与试剂

主要仪器:KD-2508型转轮式石蜡切片机(上海之信仪器有限公司)、Eclipse 50i尼康显微镜、SMZ 161体式显微镜、QSGW恒温箱(上海庆声试验仪器设备有限公司)和BN-518生物组织自动包埋机(湖北伯纳医疗科技有限公司)。

主要试剂：冰醋酸、酒精、1%番红水溶液(水配制)、1%固绿酒精溶液(水配制)、二甲苯和石蜡以及FAA 固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)。

2 试验方法与步骤

2.1 材料处理

将3种红景天根和根状茎分别洗净擦干后，迅速横切成2 mm厚的圆片。

2.2 固 定

将处理好的材料放入瓶中，加入材料体积15～20倍的FAA 固定液，分别放置在室温下固定8，12 h和16 h后，用75%乙醇震荡洗涤去除固定液。

2.3 脱水与透明

将固定后的材料依次放入75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇(Ⅰ)→95%乙醇(Ⅱ)→无水乙醇(Ⅰ)→无水乙醇(Ⅱ)的不同浓度溶液中,分别进行1 h的脱水处理后，再依次放入(1/2无水乙醇+1/2二甲苯)→(1/5无水乙醇 +4/5二甲苯100%)→二甲苯100%(Ⅰ)→二甲苯100%(Ⅱ)中进行各 1 h的材料透明处理。

2.4 浸蜡与包埋

在65 ℃的恒温条件下，将透明后的材料放入1/2二甲苯+1/2石蜡溶液中进行1 h的浸蜡处理后，再转入100%石蜡液中处理1 h，接着将材料再换入100%石蜡液中进行1 h的浸蜡处理，最后用包埋机包埋材料。

2.5 修片和切片

将石蜡包埋的材料修成矩形，放在切片机上切片。

2.6 黏 片

在黏片前，先用滴管将纯水做成凸起来的水条，再将蜡带轻轻放上去，并用滤纸吸取多余水分，最后将制得的装片放在75 ℃恒温箱中烘烤至石蜡融化。

2.7 脱 蜡

将制作的装片放在65 ℃恒温箱中烘干后，再依次放入100%二甲苯(1.5 h/次,共2次)→1/2二甲苯+1/2无水酒精溶液(1.5 h/次,共2次)→100%酒精(1.5 h/次,共2次)→蒸馏水(1 h/次,共2次)中进行脱蜡。

2.8 染色与封片

先用1%的番红水溶液染色20 min后,用蒸馏水洗涤3～5次；再用1%的固绿染色30 s后,将装片浸泡在75%的乙醇溶液中1 min后取出晾干[8]，最后再加树胶于材料表面盖上盖玻片。

3 结果与讨论

3.1 不同固定时间对切片和染色效果的影响

固定液能快速的杀死细胞并保持细胞的原有形态，以便于切片后能全部清楚地观察到细胞内的各种结构。本实验以大花红景天植物的根状茎和根为材料，采用FAA 为固定液，并设计了不同固定时间，结果见表1。

表1 不同固定时间对大花红景天切片和染色效果的影响

编号固定时间(h) 大花红景天根状茎 大花红景天根 切片效果染色效果切片效果染色效果A18较差好较好好A212好好好好A316好差好差

从表1可以看出，A 2的大花红景天根和根状茎材料固定了12 h，其切片效果和染色效果都好，具体表现为切片成蜡带状、平整且无缺损，并且各切片的染色效果也好,各部分组织细胞着色明显(见图1和图2)，这是因为采用适宜的固定时间能将植物组织材料硬化到适中的程度，并且还可增加植物组织细胞中的折光度。当A 1材料固定8 h时，其根和根状茎切片的染色效果也都好，各部分组织细胞着色明显；但切片效果均比固定12 h的差，具体为大花红景天的根切片的蜡带有少量卷曲，而根状茎切片的蜡带大部分呈现出卷曲。当A 3材料固定16 h时，其大花红景天根和根状茎的切片效果都好，切片成蜡带状、平整且无缺损，但切片的染色效果不好，表现为各部分组织细胞着色不明显。

由此可见，在石蜡切片的制作过程中，切片的材料采用不同的固定时间会明显影响到切片材料的硬化程度，并对后续切片细胞的染色都有明显的影响，这与乔秀玲等[9]的研究结论一致。

3.2 不同脱水过程对大花红景天根状茎切片制作的影响

以大花红景天根状茎为材料，研究不同脱水过程对其石蜡切片制作的影响，结果见表2。

从表2可看出，按B 1的脱水过程处理材料，切出的蜡片卷曲严重并无法展平；按B 2的脱水过程处理材料，切出的蜡片有卷曲并且蜡片还有一定损伤不太完整；按B 3的脱水过程处理材料，蜡片切片的效果好，切出的蜡片呈现为完整蜡带，且蜡带平整无缺损；最后按B 4的脱水过程共进行8 h的脱水处理，其石蜡切片的最终效果不好，这主要是因为材料经过长时间的脱水会变得非常的硬脆，以至于在最后的切片过程中材料破坏非常严重，不能切出完整的蜡片。

表2 不同脱水过程对大花红景天根状茎切片效果的影响

编号脱水过程切片效果 B175%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→90%乙醇1h→95%乙醇30min→无水乙醇(Ⅰ)30min→无水乙醇(Ⅱ)30min切片卷曲严重,无法展平。B275%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)30min →95%乙醇(Ⅱ)30min→无水乙醇(Ⅰ)1h→无水乙醇(Ⅱ)1h 切片卷曲、有损伤,不成平整蜡带。B375%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)1h→95%乙醇(Ⅱ)1h→无水乙醇(Ⅰ)1h→无水乙醇(Ⅱ)1h切片为完整蜡带状、平整无缺损。B4 75%乙醇1h→80%乙醇1h→85%乙醇1h→90%乙醇1h→95%乙醇(Ⅰ)1h→95%乙醇(Ⅱ)1h→无水乙醇(Ⅰ)1h→无水乙醇(Ⅱ)1h切片破碎严重。

注：a为木栓层；b为形成层；c为红景天髓内异型微管束；c1为红景天髓内异型微管束外侧；c2为红景天髓内异型微管束内侧；d为木栓组织环。图1 大花红景天根 图2 大花红景天根状茎 图3 长鞭红景天根状茎 图4 狭叶红景天根状茎

由此可见，在石蜡切片的制作过程中，脱水时间是影响制片效果的关键因素。如材料脱水时间过短则会导致材料脱水不彻底，对后续浸蜡、切片和染色等步骤都会有影响；但如脱水时间过长，又会导致细胞脱水严重，其结构萎缩改变很大，使得制作的切片破碎严重且结构失真。王耀文等[10]在对山药的石蜡切片制作过程中，筛选出的最佳脱水过程为70%乙醇(2 h)→95%乙醇(2 h)→95%乙醇(过夜)→无水乙醇Ⅰ(2 h)→无水乙醇Ⅱ(2 h)。由此可见，使用不同材料制作石蜡切片，其具体采用的脱水时间必须根据制作材料的特点而进行相应的调整。

3.3 3种红景天根状茎石蜡切片的显微结构比较

选择上述大花红景天根状茎切片制作过程中的最佳固定和脱水过程，对狭叶红景天和长鞭红景天的根状茎也进行石蜡切片制作，并在显微镜下观察了3种红景天根状茎的切片, 进一步从解剖学上比较了3种红景天根状茎组织结构(结果见表3)。

表3 3种红景天根状茎的组织结构特征比较

种类木栓层层数髓部异常维管束木栓组织环形成层是否明显大花红景天根状茎2～3内、外2层无明显长鞭红景天根状茎8～121层无不明显狭叶红景天根状茎7～121层有明显

通过由外到内观察(图2、图3、图4)3种红景天根状茎的石蜡切片的组织结构特点可以看出，大花红景天的木栓层较薄，仅2～3层，而狭叶红景天和长鞭红景天木栓层都较厚，均在7～8层以上；另外，还观察发现只有在狭叶红景天根状茎的皮层组织中有木栓组织环的结构存在。从对3种红景天根状茎的横切面观察发现，大花红景天和狭叶红景天其根状茎的形成层结构比较明显，而长鞭红景天根状茎的形成层结构就不明显；进一步观察3种红景天根状茎的髓部都可以发现有异常维管束的存在，分别表现为大花红景天的髓部异常维管束比较明显排列为2圈，长鞭红景天和狭叶红景天髓部异常维管束只排列为1圈，但长鞭红景天的髓部异常维管束形态不太明显。

4 结论与讨论

显微制作技术最简单的操作方法是徒手切片，但由于许多动、植物的组织软硬程度往往不太适中，所以切削很困难，也无法得到十分菲薄的切片；因此，必须先将材料经过一系列特殊处理，如固定、脱水、包埋、切片以及染色等十分繁锁的处理过程；并且，在石蜡切片的具体制作过程中，不同的材料所采取的制作方法也不完全相同，而必须要根据各种材料的特性进行合理选择。

石蜡切片是一项极具实际操作价值和意义的技术手段[11]，尽管石蜡切片法工序繁琐、技术复杂，但它最能准确地展示生物体各细胞组织间正常结构位置关系，并能很好地和长时间地保留各组织细胞的原貌，所以目前仍然是光学显微镜的主要制片方法。