基于正交设计的铁皮石斛组织培养和耐盐性研究

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(天津农学院农学与资源环境学院， 天津 300384)

铁皮石斛是观赏价值较高的花卉，在国际花卉市场中占有重要地位。铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)又名黑节草、云南铁皮，属于兰科多年生草本植物，是珍稀的药用植物和园艺植物，其含有石斛碱、石斛次碱和石斛宁等多种生物碱，具有滋阴清热、生津益胃、抗肿瘤、抗衰老和扩张血管的作用。主要分布于中国安徽、浙江、福建等地区。其茎可以入药，属补益药中的补阴药。野生铁皮石斛多生长在高山岩石阴面或森林树干上，开花结果少，繁殖能力低，自然条件下发芽率不足5%，最终导致野生铁皮石斛濒临绝迹。目前，生产上多用组培苗大棚栽培提供铁皮石斛产品，因大棚环境相对密闭，室内温度高、土壤水分蒸发量大，浇水追肥频繁，导致肥料中的盐分容易随水分上升到土壤耕层产生盐害，影响铁皮石斛的栽培效益[1]。本研究旨在对影响铁皮石斛组织培养的某些条件进行优化，并探讨盐胁迫对铁皮石斛组织培养的形态和成活率的影响，筛选出适合铁皮石斛组织培养的培养基配方，从而达到缩短其生长周期，增强繁殖能力，降低培养成本等目的，为石斛工厂化育苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

以铁皮石斛种胚为外植体进行愈伤组织、分化组织、生根苗培养，种胚来自于本实验室培养的铁皮石斛成苗。

1.2 培养条件

培养室的光照强度为2 000 lx，温度为(25±2)℃，每天光照12 h。

1.3 实验设计与统计方法

以MS为基本培养基，琼脂浓度为7 g/L，pH值为5.8。采用L4(23)正交表进行正交设计，即愈伤诱导培养、分化诱导培养、生根培养每个阶段共4个处理，每个处理重复3次，因子水平安排见表1～表3。每个处理接种12瓶，每瓶接种3～6块外植体。接种45 d后，统计铁皮石斛愈伤率(愈伤率=产生愈伤的外植体块数/接种外植体总块数的百分率)、分化率(分化率=生芽愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数的百分率)、生根率(生根率=生根组织块数/接种外植体总块数的百分率)。铁皮石斛组织培养的耐盐性实验是以基于正交设计试验得到的铁皮石斛较适培养基的基础上，分别添加浓度0.0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2% NaCl进行耐盐性筛选[2]。利用SPSS 19.0软件进行正交设计和统计分析。

表1 L4(23)铁皮石斛愈伤诱导正交试验设计

水平因素6-BA(mg/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)10.50.51520.5130310.53041115

表2 L4(23)铁皮石斛分化诱导正交试验设计

水平因素KT(mg/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)11.50.41521.50.83033.00.43043.00.815

表3 L4(23)铁皮石斛生根培养正交试验设计

水平因素活性炭(g/L)NAA(mg/L)蔗糖(g/L)110.215210.430300.230400.415

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛愈伤组织的诱导

不同浓度NAA、6-BA和蔗糖对铁皮石斛愈伤组织诱导结果见表4和表5。不同浓度NAA和不同浓度6-BA对铁皮石斛愈伤组织诱导均存在极显著差异(p<0.01)，即添加浓度为1.0 mg/L NAA的培养基愈伤诱导率极显著高于0.5 mg/L；添加浓度为1.0 mg/L 6-BA的培养基愈伤组织诱导率极显著高于0.5 mg/L。而不同蔗糖浓度对铁皮石斛愈伤诱导率差异并不显著。由于因素内水平极差的大小能够说明该因素对铁皮石斛愈伤诱导率的影响程度，进一步就NAA、6-BA和蔗糖3因素对铁皮石斛愈伤诱导率的影响进行分析(表5)可知，参试3因素极差依次为15.2、9.9、1.7，因此，对铁皮石斛愈伤诱导率影响的主次关系为F>E>G，即依次是NAA、6-BA和蔗糖，根据参试各因素水平的大小，可得到铁皮石斛愈伤诱导率最优水平组合为：E2F2G1。

表4 铁皮石斛愈伤组织诱导L4(23)正交试验结果

序号因素(E)6-BA(F)NAA(G)蔗糖愈伤率(%)10.50.51567.420.51.03081.531.00.53076.141.01.01592.7

表5 不同浓度 NAA、6-BA及蔗糖对铁皮石斛愈伤诱导率的差异显著性试验

因素 愈伤率 显著性 EFGEFGEFG(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.00.51584.471.980.5aAaAaA0.51.03074.587.178.8bBbBaA

2.2 铁皮石斛分化组织的诱导

不同浓度KT、NAA和蔗糖对铁皮石斛分化组织诱导试验结果见表6和表7。不同浓度KT、不同NAA和不同蔗糖对铁皮石斛分化组织诱导均存在差异，即浓度为1.5 mg/L KT的分化组织诱导率极显著高于3.0 mg/L(p<0.01)，0.8 mg/L NAA的分化组织诱导率极显著高于0.4 mg/L(p<0.01)，30 g/L的蔗糖分化组织诱导率显著高于15 g/L(p<0.05)。进一步就KT、NAA和蔗糖3因素对铁皮石斛分化率的影响进行分析(表7)可知，参试3因素极差分别为14.6、28.7、6.9，因此，对铁皮石斛分化组织诱导率影响的主次关系为L>K>M，即依次是NAA、KT和蔗糖，根据各因素水平的大小，可得到铁皮石斛分化组织诱导率最优水平组合为：K1L1M1。

表6 铁皮石斛分化组织诱导L4(23)正交试验结果

序号因素(K)KT(L)NAA(M)蔗糖分化率(%)11.50.41592.921.50.83060.333.00.43071.443.00.81552.6

表7 不同浓度KT、NAA及蔗糖对铁皮石斛分化组织诱导率的差异显著性试验

因素 分化率 显著性 KLMKLMKLM(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.50.41576.682.272.8aAaAaA3.00.83062.056.565.9bBbBbA

2.3 铁皮石斛生根苗的诱导

不同浓度活性炭、NAA和蔗糖对铁皮石斛生根苗诱导的影响试验结果见表8和表9。不同浓度活性炭和不同浓度蔗糖对铁皮石斛生根苗诱导率影响都存在显著差异(p<0.01)即培养基中添加浓度为1.0 mg/L活性炭的生根苗诱导率极显著高于不添加活性炭的培养基，培养基中添加30 g/L的蔗糖生根苗诱导率极显著高于15 g/L。而不同浓度NAA对生根苗诱导率差异不显著。由表9可知，参试3因素活性炭、NAA和蔗糖的极差分别为11.7、1.8、21.3，因此，对铁皮石斛生根苗诱导率影响的主次关系为P>N>O，即依次为蔗糖、活性炭和NAA，根据各因素水平的大小，可得到铁皮石斛生根苗诱导最优水平组合为：N1O2P2。其最优组合的平均根长和株高分别为23.0 mm、31 mm。

图1 愈伤组织增殖

图2 分化组织增殖

表8 铁皮石斛生根苗诱导的L4(23)正交试验结果

序号因素(N)活性炭(O)NAA(P)蔗糖根长(mm)株高(mm)生根率(%)11.00.21518.527.063.121.00.43023.031.082.530.00.23021.029.072.640.00.41516.130.549.6

表9 不同浓度活性炭、NAA、蔗糖对生根苗诱导率的差异显著性试验

因素 生根率 显著性 NOPNOPNOP(mg/L)(mg/L)(g/L)(%)(%)(%)0.050.010.050.010.050.011.00.21572.867.956.3aAaAaA0.00.43061.166.177.6bBaAbB

3 铁皮石斛组织培养耐盐性研究

由表10可知，当NaCl浓度在0.3%及0.3%以下时，铁皮石斛愈伤组织、分化苗及生根苗均能基本正常生长。当NaCl浓度为0.6%时，接种的铁皮石斛外植体经盐胁迫处理60 d后，愈伤组织生长明显受到抑制，成活率只有0.13%。随着NaCl浓度继续增加，抑制作用越大，当NaCl浓度达到1.2%时，铁皮石斛愈伤组织全部失水枯萎死亡；当NaCl浓度在0.3%～0.6%时，铁皮石斛分化苗受害非常明显，成活率由88.46%降到44.44%。当NaCl浓度为0.9%～1.2%时，由于铁皮石斛分化苗随着盐浓度的增加，受到盐的侵害也逐渐失水枯萎。除此之外，随着NaCl浓度增加，铁皮石斛幼苗生根的数量及其根系的长度均有显著的抑制作用，当NaCl浓度为0.6%时，成活率不及对照组的1/2；当盐浓度在0.9%时，铁皮石斛苗幼根停止生长；当NaCl浓度到了1.2%时，铁皮石斛生根苗逐渐黄化枯萎乃至死亡。因此，本研究确定铁皮石斛愈伤组织耐盐性临界浓度为 0.6%，分化组织耐盐性临界浓度在0.3%～0.6%之间，生根苗耐盐性临界浓度在0.6%～0.9%之间。

表10 铁皮石斛耐盐性试验结果

NaCl浓度(%) 接种数 成活率(%) 愈伤组织分化组织生根苗愈伤组织分化组织生根苗0.0908472100.00100.00100.000.390907863.3076.6788.460.69072810.1329.1744.440.99090780.0310.0023.081.29390840.000.003.57

4 讨 论

4.1 不同培养基对铁皮石斛愈伤组织、分化组织及生根苗的影响

正交试验结果表明，铁皮石斛愈伤组织增殖的最佳培养基为 MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖15 g/L；分化组织增殖的最佳培养基为MS+NAA 0.4 mg/L+KT 1.5 mg/L+蔗糖15 g/L；铁皮石斛生根的最适培养基为MS+活性炭1.0 g/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L，其中，本实验中是否添加蔗糖对铁皮石斛生根的影响并不显著。这与王睿等[1]的研究结果略有不同，究其原因，可能是因为使用的激素和内容物不同。王睿等的研究中，铁皮石斛组织培养使用了土豆泥、香蕉汁等天然营养物，而本试验并没有使用天然营养物，这可能是造成实验结果不一致的原因。

图3 分化苗生根

4.2 活性炭对铁皮石斛组织培养生根苗的作用

活性炭材料是一种经过加工处理所得的无定形碳，具有很大的比表面积，对气体、溶液中的无机或有机物质及胶体颗粒等都有良好的吸附能力[3-4]。在铁皮石斛组织培养的培养基中加入活性炭，可吸附代谢过程的废弃物，防止组织褐变，促进胚胎发生与生根具有重要作用[5-6]。在本试验中，铁皮石斛生根苗最适培养基为MS+活性炭1 mg/L+NAA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L，对比添加活性炭的培养基和未添加活性炭的培养基，添加活性炭的生根苗根系普遍更为粗壮，生长状况良好，说明在培养基中添加活性炭可以促进生根苗的壮根与生长。试验中还发现在未添加活性炭的培养基中有染菌现象，而添加活性炭的培养基中没有染菌现象，这就说明活性炭不仅能吸附培养基中的有害物质，而且还具有杀菌的能力。

4.3 铁皮石斛组织培养的耐盐性

李国树等[2]，林栖凤等[7]研究指出，失水萎蔫是盐渍下多种植物最迅速最严重的盐害症状，它直接导致植株死亡。叶片枯焦和黄化是植物在较低盐胁迫下主要盐害症状。本实验发现，铁皮石斛的愈伤组织、分化组织、生根苗的受害程度随NaCl浓度的增加其伤害程度加深，但不尽相同。当NaCl浓度在0.3%时，铁皮石斛生长发育基本正常；当NaCl浓度高于0.6%时，铁皮石斛愈伤组织、分化组织、生根苗的生长发育均受到严重抑制；当NaCl浓度增加到1.2%时，铁皮石斛愈伤组织、分化组织、生根苗致死率几乎为100%。实验中还发现，铁皮石斛分化组织伤害程度低于愈伤组织，而生根苗伤害程度低于分化组织，由此证明，铁皮石斛生根苗耐盐性高于愈伤组织和分化组织。