蓝粒小麦育种衍生材料的改良及选育

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(1.贵州农业职业学院， 清镇 551400； 2.贵州省旱粮研究所， 贵阳 550006；3.贵州省农业科学院， 贵阳 550006)

蓝粒小麦是长穗偃麦草(AgropyronelongatumL.，10 x=70)与普通小麦(Triticumaestivum, 6 x=42)复合杂交后代中选育出来的优良品种，是扩展和补充普通小麦遗传多样性的重要种质资源，其外形与普通小麦相同，染色体为42条，种子的胚乳呈蓝色，蓝色胚乳性状的相关基因存在于代换到小麦中的一条长穗偃麦草染色体上[1-2]。蓝粒小麦具有许多普通小麦没有的优良抗逆性状，如成熟期落黄好，抗穗发芽能力强，高抗白粉病、条锈病，中抗叶锈等，同时含有丰富的蛋白质、氨基酸、花青素和硒、铁、锌、钙、碘等微量元素，营养价值较高，具有重要的保健作用，在改良小麦的抗性、提高品质方面具有重要的利用价值[3-6]。

开展蓝粒优质小麦遗传改良研究是我国特色小麦种质创新的重要尝试。贵州省旱粮研究所将引种的蓝粒小麦资源——贵阳绿麦进行了改良选育，现拥有91份蓝粒小麦中间材料，于2001年用贵阳绿麦作母本与父本自育组合9988 F2进行有性杂交，通过贵阳、兴义、昆明等地穿梭选育，成功育成二体代换系黔绿麦1号。本研究通过田间农艺性状调查、品质、矿物质检测，杂交组合配制，SDS-PAGE及SSR分子标记技术，对育种衍生材料进行改良和选育，以筛选出稳定的蓝色小麦新品系供生产利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用材料为蓝粒小麦衍生后代，由贵州省农业科学研究院旱粮研究所引种，并重组获得，在该所小麦试验地种植。

1.2 实验方法

1.2.1 农艺性状调查、品质及矿物质检测

调查株高、穗长、穗粒数、芒长、茎干弹性、生育期、千粒重等指标，每个株系3个重复。粗蛋白(干基)、湿面筋含量(14%湿基)、沉淀指数(14%湿基)、稳定时间、面条评分、小圆饼干扩展系数、钙、铁、锌、硒。

1.2.2 杂交组合配制

以黔绿麦1号为母本，以普通小麦05中27，黔9504，绵阳2002，夏繁22为父本配制的4个组合，以黔绿麦1号为父本，普通小麦05中27，黔9504，绵阳2002，夏繁22为母本配制的反交组合4个。

1.2.3 SSR标记

1) DNA的提取。利用特异标记Xgwm 165对杂交组合的F2代共494个单株进行了标记检测，蓝粒单株叶片DNA提取采用改良的CTAB法[7]。

2) PCR扩增。PCR反应采用10μL体系(表1)，PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR完成后，10μL反应体系中加入6×上样缓冲液2μL，混合均匀。电泳采用8%的非变性的聚丙烯酰胺凝胶，银染法检测。显影后，在白炽灯下观察电泳结果，进行条带统计和照相(统计500 bp以下的片段， 片段大小是以100 bp DNA Ladder为标准判断)。

1.2.4 SDS-PAGE

分析了衍生材料的高分子量麦谷蛋白亚基组成。种子高分子量谷蛋白(HMW-GS)的提取参考Marchylo[8]和Sutton的方法[9]。SDS-PAGE电泳分析参照Gupta[10]的方法。

表1 PCR反应体系

贮存液终浓度10×buffer(含500mM KCl)1×1μL25mMMgCl21.5mM0.6μL10mMdNTP200μM0.2μL5μM primer F350nM0.7μL5μM primer R350nM0.7μL50ng/μL DNA模板5ng/μL1μL2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.05U/μL0.2μLddH2O—5.6μL共计10μL

2 结果与分析

2.1 农艺性状调查及品质和矿物质检测

黔绿麦1号属弱冬性小麦品种，长芒，白壳，绿色籽粒，株高81 cm，穗长8.4 cm，穗粒数53粒/穗，茎秆弹性好，抗倒伏，生育期偏晚，千粒重39 g，15万/667 m2基本苗情况下穗数可达27万/667 m2。分蘖力强，叶色浓绿，分蘖期叶片上冲，抽穗期旗叶半披散，成熟期落黄好，籽粒半硬质，抗穗发芽能力强。高抗白粉病、条锈病，中抗叶锈病，适宜在贵州省内贵阳、毕节、遵义等地种植。

图1 种植于田间的黔绿麦1号

钙含量0.242 mg/kg，比普通小麦粉钙含量增加60%；铁含量102.5 mg/kg，较普通小麦粉铁含量高出2.05倍；锌含量49.175 mg/kg，较普通小麦粉锌含量高出2.73倍；硒含量0.204 mg/kg，较普通小麦粉硒含量高出20倍，比中普绿麦1号增加25%(贵州大学农产品食品质量安全检测中心检测)。

粗蛋白(干基)含量为16.15%，湿面筋含量(14%湿基)34.8%，沉淀指数(14%湿基)60.7 mL，稳定时间2.9 min，面条评分86.6分，小圆饼干扩展系数66，属优质中筋小麦，适合制作面条、糕点等食品(农业部谷物品质检验中心检测)。

注：Marker为100 bp DNA Ladder，C为CN 04-1；J为贵阳绿麦；1～36为F2群体里蓝粒单株，目标条带位置为170 bp左右。图3 Xgwm 165 PCR检测结果

注：从左到右依次为 ：蓝粒小麦衍生后代0147/05中27 F3代 25份材料图4 高分子量谷蛋白亚基组成

2.2 杂交组合配置

2.2.1 F1代植株上蓝、黄粒种子粒数比例

以黔绿麦1号为母本的4个杂交组合，F1代植株上黄、蓝粒数的比例为(77～99)∶100，平均为87.5∶100，即黄粒占总粒数的46.6%；而以黔绿麦1号作父本时，F1代植株上黄、蓝粒数的比例为(75～90)∶100，平均为86.8∶100，即黄粒占总粒数的46.5 %(表2)。

表2 F1代植株上蓝黄粒比例

杂交组合总粒数黄粒数蓝粒数黄蓝粒比例黔绿麦1号×05中2759432962298199∶10005中27×黔绿麦1号117753464383∶100黔绿麦1号×绵阳2002117095083662677∶100绵阳2002×黔绿麦1号24221136128688∶100黔绿麦1号×夏繁2244732159231493∶100夏繁22×黔绿麦1号2176931124575∶100黔绿麦1号×黔950452502574267696∶100黔9504×黔绿麦1号82683926434290∶100

图2 F2单株籽粒颜色分离

2.2.2 F2代植株上黄、蓝粒分离情况

以F2代种子分黄、蓝粒成对种植的株行中选择单株，在黄粒行中选出20个单株，在蓝粒行中选出28个单株。结果表明：在黄粒行中有13个单株穗上的种子全为黄粒，有7个单株穗上的种子有极少数的蓝粒种子，蓝、黄粒的比例为(0.77～3.85)∶100，平均为1.98∶100(表3)。

当选的来自蓝粒行的28株F2代植株，再根据组合来源分别加以分析，结果见表4。以黔绿麦1号作父本的3个杂交组合，种色仍有分离，中选蓝粒单株分别为05中27×黔绿麦1号组合5株，绵阳2002×黔绿麦1号组合13株，夏繁22×黔绿麦1号组合10株。3个组合的F2代植株上黄、蓝粒种子数的比例为(64～88)∶100，平均为73.7∶100，即黄粒占总粒数的42.4 %(表3、表4)，这比上一代的46.5%略有降低。

2.2.3 蓝粒小麦对普通小麦在田间自然授粉异交情况

蓝粒小麦与普通小麦田间自然授粉的异交情况，以蓝粒小麦的种子蓝色作为标记基因，可以在不去雄的情况下，进行自然授粉，普通小麦穗上有蓝色种子，蓝粒小麦穗上有黄粒种子，即为蓝粒小麦与普通小麦的异交种。从试验结果看出，6个普通小麦品种，每小区种植2～4行，小区收获混合脱粒后，带有蓝色种子的粒数为20～68粒，自然异交率为1.26%～5.15%，平均为2.66%。

2.3 SSR标记

对绿麦杂交组合的F2代共494个单株进行了标记检测(图3)，在后代材料的检测中，由于播种时选取的均为蓝粒，检测结果除其中1株未扩增出目标条带，其它493株均能扩增出270 bp目标条带。

表3 F2代当选单株穗上蓝黄粒分离情况

当选单株总株数全黄粒株蓝黄粒株黄粒数蓝粒数黄蓝粒比例黄粒株20137417209881.98∶100蓝粒株28028127111725673.7∶100

表4 F2代蓝粒植株上蓝黄粒比例

杂交组合株数总粒数黄粒数蓝粒数黄蓝粒比例05中27×黔绿麦1号532671533173488∶100绵阳2002×黔绿麦1号13132585932732681∶100夏繁22×黔绿麦1号10134425246819664∶100

表5 蓝粒小麦衍生后代HMW-GS组成

材料Glu-A1Glu-B1Glu-D1材料份数Null202+12251202+125172+122Null72+1280147/05中27F3Null13+192+127113+192+123Null7+92+127172+121Null72+121205中27/0147F3Null202+1218Null13+192+121113+192+1211204+121Null202+12300147/9938F31202+12221202+12109938/0147F3Null202+121217+92+1210147/9988-43F3Null202+12271202+12209988-43/0147F3Null202+1214Null202+12131202+123Null205+107Null75+104Null7+92+1210147/MY2002-2F3Null72+4+121Null13+195+103Null7+82+121Null13+192+121Null14+155+101172+121Null72+121Null72+122Null7+92+125Null202+125MY2002-2/0147F3Null202+5+102Null13+195+107Null205+107Null75+1041202+1221202+12190147/夏繁22F3Null202+1230Null202+1232夏繁22/0147F3Null222+1231202+1212

2.4 SDS-PAGE分析蓝粒小麦衍生后代HMW-GS组成及等位变异

Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点上上的等位变异分别为2、6、5种，3个位点上的优势亚基分别是Null(占80.44%)，20，13+19(占87.88%)，6,33%，2+12(占89.81%)。在Glu位点共检测到18种亚基组合，组合(Null、20、2+12)为优势亚基组合。这些蓝粒小麦衍生后代可作为改良小麦品质性状的重要遗传资源。

3 讨 论

Xgwm 165在亲本CN 04-1和贵阳绿麦之间具有多态性，利用Xgwm 165来验证F2群体中的494个蓝粒单株，仅1株未扩增出目标条带，说明270 bp条带与蓝粒基因紧密连锁，交换率仅为1/494。据此推论贵阳绿麦和魏利青[11]研究的乌麦526的蓝粒基因可能为同一来源。Xgwm 165扩增出的条带差异明显，准确率高，可以用作贵阳绿麦组合后代蓝粒基因的追踪选择。

蓝粒小麦衍生后代材料的高分子量谷蛋白亚基中变异相对偏少，亚基组合为18种类型，Null、20、2+12为优势亚基。Glu-D1位点上5+10亚基对小麦加质效应明显被称为优质亚基，提高5+10等优质亚基的频率是改善我国小麦品质的重要措施，可见，蓝粒小麦在品质上有很大的提升空间，育种时可与优质亲本相互组配，从杂交后代中选择具有双亲的优质亚基的高分子量麦谷蛋白亚基组合，进而提高蓝粒小麦的面包烘烤品质。