重组LHCⅡ与叶绿素a的体外结合及其光电性能表征

侯琪琪, 于 倩, 李 泉, 李荣贵, 秦 松, 葛保胜

(1. 青岛大学 生命科学学院, 青岛 266071; 2.中国石油大学(华东)生物工程与技术中心, 青岛 266555; 3. 中国科学院 烟台海岸带研究所, 烟台 264003)

LHCⅡ(Light harvesting complex Ⅱ)是植物光合系统Ⅱ(PSⅡ)中的一类重要的捕光色素-蛋白复合物，又称捕光天线复合物，是类囊体膜蛋白中含量最丰富的蛋白，约占类囊体膜蛋白总数的30%，结合叶绿体中大约50%的叶绿素[1]。据报道，一个LHCⅡ分子可以结合14个叶绿素分子，其中包括8个叶绿素a和6个叶绿素b[2]。叶绿素a/b的选择性结合主要取决于其结合位点周围氢键供体的性质，如LHCⅡ的叶绿素结合位点周围的谷氨酰胺侧链酰胺基可以作为供体，与叶绿素b的C7-甲酰基形成氢键，而亮氨酸的非极性侧链更适合与叶绿素a分子的C7-甲基结合[3]。

研究表明，在植物光合系统中的色素-蛋白复合物能够高效捕获太阳能，并将其通过光合作用转化为化学能[4]。随着染料敏化太阳能电池的深入研究，生物基的染料敏化太阳能电池凸显出更多的优势，如捕光效率高、天然无污染等[5]。同时，捕光天线复合物还能够在弱光条件下吸收光能，然后由天线复合物吸收的光能又转移到光反应中心PSⅠ或者PSⅡ[6-8]。PSⅡ中的捕光复合物LHCⅡ在光能向PSⅡ或者PSⅠ的转移过程中起到了关键的作用，相对其他的光合蛋白，LHCⅡ不仅捕光效率高，还更加稳定[9]。科学家已经尝试将LHCⅡ固定在光电阳极上，以期深入了解该色素-蛋白复合物光电流产生的机理，人们希望能够通过模拟该系统将光能转变成可供人类使用的电流[10]。然而，天然提取LHCⅡ过程中，不仅操作步骤繁多，收率较低，而且需要用表面活性剂将LHCⅡ从类囊体膜上溶解下来，往往会造成LHCⅡ的结构破坏。因此，以上因素极大地限制了LHCⅡ的大规模制备及其应用。

本文利用基因工程技术将莱茵衣藻lhcII基因在大肠杆菌中进行过量表达，经纯化获得重组LHCⅡ蛋白，并在体外与叶绿素a进行重建，将得到的色素-蛋白复合物吸附在TiO2电极上，组装生物基染料敏化太阳能电池，进行光电表征，并将其与叶绿素a敏化太阳能电池进行对比，从而为LHCⅡ敏化的生物基太阳能电池提供重要的工作参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所用莱茵衣藻lhcⅡ基因(NCBI Accession：P27523.1)由通用生物有限公司合成；所用EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)和载体pET-28a由本实验室保存；TaqDNA、限制性内切酶BamH I、SacI、T4 DNA ligase、10×Loading buffer、D2000 DNA Ladder等均购自Takara公司；普通质粒小提试剂盒购自天根生物科技有限公司；TiO2电极片购自大连七色光科技有限公司。

NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo)；AKTA 蛋白纯化系统(GE)；UV-1700型紫外可见分光光度计(SHIMADZU)；FluoroMax-4荧光光谱仪(Horiba Jobin Yvon)；质谱仪 MALDI-TOF(Bruker)；太阳能测试系统(美国颐光科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 提取质粒

将商业合成公司提供的pUC19-lhcII质粒和本实验室保存的空载体pET-28a分别转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，过夜培养后提取质粒。质粒的提取根据天根普通质粒小提试剂盒说明书中的步骤进行操作。提取后的质粒用NanoDrop 2000 spectrophotometer测定浓度，pUC19-lhcⅡ平均浓度为166.5 ng/μL，pET-28a的平均浓度为79.2 ng/μL。

1.2.2 目的基因与载体的双酶切及连接

将pUC19-lhcⅡ质粒和pET-28a质粒分别用SacⅠ和BamHⅠ进行双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收DNA产物。

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将胶回收得到的目的基因与载体按照5∶1比例进行混合，经T4 DNA连接酶16℃连接过夜，从而构建表达载体pET-28a-lhcⅡ，将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，进行单克隆培养，并测序。

1.2.3 扩大培养、目的蛋白纯化及表征

测序结果正确后，将目的基因提取质粒，转化进大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，在100 mL的LB培养基中过夜培养后，将种子液按照1∶100的比例接入1 L的TB培养基中进行扩大培养，培养至OD=0.8左右时，加入2 mmol/L的乳糖进行诱导，诱导后18℃培养18～20 h后，收集菌体。

利用Ni2+亲和色谱柱纯化法进行蛋白纯化。后期表征，发现蛋白易形成包涵体，所以用含8 mol/L尿素的Buffer将包涵体溶解，上样后移至AKTA蛋白纯化系统，用含有2 mol/L尿素的洗脱液进行蛋白洗脱并脱盐，除去尿素后复性。将纯化出的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳和质谱分析。

1.2.4 LHCⅡ与叶绿素a的体外结合

将上述纯化获得的LHCⅡ重组蛋白，经脱盐柱交换buffer到重组缓冲液中，按照如下的重组方法进行结合重组：首先从螺旋藻中提取叶绿素a[11]，然后取400 μg从大肠杆菌中提取的重组LHCⅡ蛋白，溶解在1000 μL的重组Buffer中(含有100 mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0，5 mmol/L的DTT，1 mmol/L的PMSF，12.5%的蔗糖和2%的LDS)。将该蛋白溶液于100℃加热3 min，超声10 min，随后加入100 mmol/L二硫苏糖醇及70 μL的色素乙醇溶液(3.5×10-5mol/L)，将混合物再超声10 min。通过冰冻(1 h，-20℃)和解冻(30 min，室温)3个循环周期，实现蛋白与色素的重建[12]。反复冻融结束后，将样品放在冰上孵育15 min，最后将混合物放置在含有10 mmol/L HEPES的10 mL的蔗糖梯度(0.2～1 mol/L)中，35 700 r/min离心16 h[13]。将下游含有重建的色素-蛋白复合物的绿色带(在约0.4 mol/L的蔗糖密度处)用注射器小心收集起来。将收集好的色素-蛋白复合物利用紫外分光光度计和荧光光谱仪进行检测。

1.2.5 结合率曲线测定

据报道，螺旋藻中主要含有叶绿素a[14]，因此可以根据朗伯比尔定率进行叶绿素浓度的计算：A=Εbc，其中A为吸光度，Ε为吸收系数，叶绿素a在95%乙醇溶液中，在664 nm处的吸光系数为84.6[15]，b为样品浓度(g/L)，c为光程(1 cm)。

蛋白浓度的测定采用Bradford(考马斯亮蓝法)[16]，操作方法根据Bradford试剂盒(TIANGEN)说明书操作，目的蛋白的分子质量为27 829.48 u。

1.2.6 光电性能表征

将重建后的色素-蛋白复合物和同浓度的纯叶绿素a溶液进行光电性能表征，比较两种生物基染料敏化剂的光能传递效率。经过紫外分光光度计的测定，LHCⅡ中叶绿素a的浓度为4.5×10-5mol/L，配置同浓度的叶绿素a溶液。将活化后的染料敏化太阳能电池的TiO2电极片分别放入上述两种溶液中，在暗处吸附24 h后，组装太阳能电池，安装在太阳能测试系统(美国颐光科技有限公司)上进行测试[17]。

2 结果与分析

2.1 目的基因与载体双酶切

pET-28a空质粒和携带目的片段的pUC19-lhcⅡ质粒经双酶切后分别进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示。从图中可以看出酶切后在约3、6和1 kb偏下处出现3个明显的DNA条带。泳道1在6 kb处出现明显DNA条带，质粒载体pET-28a的分子量为5369 bp，由电泳图中可以看出酶切后的质粒分子量在5 kb到6 kb之间，与理论值相符，证明该质粒酶切成功。泳道2中3 kb处应为pUC19载体；lhcⅡ目的基因片段分子量为687 bp，故该泳道1 kb以下处为lhcⅡ目的基因条带，该条带分子量与理论值基本相符，证明酶切也得到相应的目的基因片段。将DNA片段回收连接后，酶连接产物送上海生工公司测序后，比对测序结果后发现均正确，因此可以得知目的基因lhcⅡ与载体pET-28a已成功连接，可以将备份菌液活化提取质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21中，进行菌株的扩大培养和蛋白的纯化。

图1 pET-28a和pUC19-lhcⅡ质粒双酶切后琼脂糖电泳图

M:双酶切Marker；1:pET-28a；2:pUC19-lhcⅡ

2.2 SDS-PAGE电泳和质谱分析

将所培养收集到的菌体破碎离心后，利用Ni2+亲和色谱法从上清中提取目的蛋白，经洗脱纯化后，发现目的蛋白浓度较低，仅为0.12 mg/mL。经SDS-PAGE(如图2-A)分析发现，洗脱产物中仅存在少量目的蛋白，且纯度不高。包涵体组分里存在明显的LHCⅡ目的蛋白条带，因此判定该蛋白主要表达存在于包涵体中。因此将包涵体组分用8 mol/L尿素溶解后，利用Ni2+亲和色谱法，从包涵体中纯化目的蛋白。

由图2-A发现，经包涵体纯化后，条带6和7只有一条位于28 ku左右的条带，可知从包涵体中提取的蛋白较纯，基本无杂蛋白。由图2-B质谱图可以看出，目的蛋白分子量为27 871.968 u，与理论蛋白分子量27 829.48 u基本符合，可以确定已成功分离纯化获得目的蛋白LHCⅡ。

图2 经Ni2+亲和色谱纯化后各蛋白组分的SDS-PAGE电泳图(A)和目的蛋白LHCⅡ质谱图(B)

M：Marker；1：破碎液上清；2：流穿液；3：从可溶性组分纯化的目的蛋白；4：包涵体；5：包涵体组分流穿液；6-7：包涵体组分洗脱的目的蛋白

2.3 LHCⅡ与叶绿素a的体外结合

将所获得的色素-蛋白复合物进行蔗糖密度梯度(0.2～1.0 mol/L)离心，结果(如图3)显示，叶绿素a由于分子量小被分离到蔗糖梯度的上层，而色素-蛋白质复合物由于分子量大可以被分离到下层从而与叶绿素a分开。由图3可以看出，在蔗糖梯度最上层有被分离出的未结合的游离叶绿素a，而在蔗糖梯度约0.4 mol/L位置有绿色的条带，初步判断是结合上叶绿素a的LHCⅡ复合物。用注射器将中间的绿色条带小心吸出，并用紫外和荧光进行检测(如图4)。

图3 蔗糖密度离心

A：经脱盐柱分离后的色素蛋白复合物；B：未经脱盐柱分离的色素蛋白复合物

通过紫外分光光度计分析可知，游离叶绿素a分子在418 nm和660 nm处有紫外吸收峰，280 nm处并没有明显的紫外吸收峰。而重建后所分离得到的色素-蛋白复合物，在280 nm处有明显的蛋白峰，相对于从螺旋藻中提取的叶绿素a而言，体外重组的LHCⅡ复合物在415 nm处的吸收峰有3 nm的蓝移，在662 nm处的吸收峰有2 nm的红移。因此可以说明LHCⅡ和叶绿素在体外已经有效结合。

为进一步证明LHCⅡ与叶绿素a的成功结合，我们对复合物进行荧光光谱的检测。经在418 nm处进行激发，重组色素蛋白复合物最大发射峰在671 nm，与天然LHCⅡ相符。进一步说明LHCⅡ与叶绿素a在体外重建成功。

图4 叶绿素a和色素-蛋白复合物的紫外吸收光谱(A)和色素-蛋白复合物的紫外吸收光谱和荧光发射光谱(B)

2.4 结合率饱和曲线的测定

为了进一步验证重组LHCⅡ蛋白与叶绿素a的结合效率，我们对二者结合的饱和曲线进行了测定。所用蛋白在595 nm处的吸光度为0.262，根据Bradford蛋白定量方法所得标准曲线Y=X+0.0045(图5-A)，计算的蛋白质含量为0.2575 mg/mL，即9.25 mmol/L。所加入叶绿素a含量的计算方法参照1.2.5中所述，随着加入的叶绿素a与蛋白的比值的增高，色素-蛋白复合物中，蛋白结合的叶绿素a的变化趋势如图5-B所示。随着加入的叶绿素a与LHCⅡ的比值的增加，在重建的色素-蛋白复合物中叶绿素a与LHCⅡ的结合率也不断增加，最终，结合率在8.0左右达到平衡，因此认为通过基因工程手段得到的LHCⅡ最多可以结合8个叶绿素a。这也与天然LHCⅡ蛋白可以结合8个叶绿素a分子相符，这表明重组LHCⅡ具有与天然LHCⅡ同样的叶绿素结合能力。

图5 叶绿素a和LHCⅡ结合曲线的计算

A：Bradford蛋白定量BSA标准曲线；B：叶绿素a与LHCⅡ的结合曲线

2.5 光电性能表征

将上述重建获得的色素-蛋白复合物和相同浓度的叶绿素a分子，按照1.2.6所述方法吸附到纳米TiO2电极上，组装成生物基染料敏化太阳能电池，并进行光电性能表征。结果如表1，复合物和叶绿素a的I-V曲线如图6。在AM1.5，光照强度为100 mW/cm2时，色素-蛋白复合物短路电流ISC为0.493 mA/cm2，开路电压VOC为0.491 V，填充因子FF为0.679，效率η为0.165%；叶绿素a的短路电流ISC为0.596 mA/cm2，开路电压VOC为0.482 V，填充因子FF为0.676，效率η为0.194%。相较下，叶绿素a表现出相对较好的光电性能。

表 1 染料敏化TiO2太阳能电池的性能(AM1.5,100 mW/cm2)

3 讨论与结论

天然的LHCⅡ的提取工艺复杂，得率比较低，且需要使用表面活性剂将其从类囊体膜上溶解下来，容易造成LHCⅡ分子结构的破坏及叶绿素脱落[18]。本实验成功构建pET-28a-lhcⅡ质粒，在大肠杆菌BL21中培养表达后，经过Ni2+亲和层析获得重组LHCⅡ目的蛋白，此方法简单易行，成本较低，且易获得大量的LHCⅡ蛋白。经过验证，将从包涵体中纯化的蛋白经柱上复性之后，可以在体外成功与叶绿素a进行结合，且重组后LHCⅡ复合物的紫外吸收和荧光发射光谱都与天然LHCⅡ类似，这表明复性后的重组LHCⅡ具有结合叶绿素的活性。在此基础上，通过不断地增加重建过程中叶绿素a的量，最终使LHCⅡ与叶绿素a的结合率达到饱和，测定了色素-蛋白结合的饱和滴定曲线。经过计算可得，每个重组LHCⅡ蛋白最多可以结合8个叶绿素a分子，与天然LHCⅡ的色素结合活性一致，这进一步证明复性后所获得的LHCⅡ保持了与天然LHCⅡ类似的生物活性。有文献报道，LHCⅡ的化学变性过程是可逆的[19]，这或许可以解释经包涵体复性后的LHCⅡ可以较好地保持其生物活性的原因。

图6 LHCⅡ复合物敏化TiO2太阳能电池的I-V曲线(A)和叶绿素a敏化TiO2太阳能电池的I-V曲线(B)

将结合8个叶绿素a的LHCⅡ和相同浓度的叶绿素a溶液分别吸附到染料敏化太阳能电池的TiO2电极上，组装生物基染料敏化太阳能电池，经光电性能测试发现，重建的LHCⅡ色素-蛋白复合物和纯叶绿素a都可进行完整的电子传递，两种材料的光电转换效率差别不大，叶绿素a的光电转换效率稍高于LHCⅡ。分析其原因可能是由于叶绿素a分子质量小，同样条件下，叶绿素a在光电阳极上的吸附效果好，所以表现出较好的光电性能。在此基础之上，我们希望通过不断地摸索，可以得到获得效果更佳的染料敏化太阳能电池的敏化剂。本研究为大规模制备LHCⅡ并将其应用于生物基染料敏化太阳能电池奠定了重要的工作基础。