生活饮用水中菌落总数和大肠埃希菌检测能力验证

林锏锐 庞晓林 丁秀琼 郑俏慧 刘骁 杨劲

1.中国检验认证集团广东有限公司湛江分公司广东湛江524000；2.湛江海关(原湛江出入境检验检疫局)

1 前言

实验室能力验证，是指利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[1]。是为确保实验室维持较高的校准和检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。实验室能力验证可以确定实验室进行某些特定的检测能力，可以了解到新的检测方法的有效性和可比性，可以利用评价数据对实验室的质量管理要素如检测标准(方法)的确认、仪器设备、人员技术能力、质量控制情况进行分析[2]。2016年湛江检验检疫局技术中心食品实验室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心(ACAS)的生活饮用水中菌落总数和大肠埃希菌的检测能力验证，取得了满意的结果。

2 材料与方法

2.1 待测样品

ACAS-PT208“生活饮用水微生物指标菌检验能力验证”样品共两瓶。棕色西林瓶内装白色冻干物，样品标识分别为:16-R152、16-M282；由ACAS提供。

2.2 主要培养基试剂

乳糖蛋白胨培养液(批号:160516)，EC-MUG培养基(批号:150410)，营养琼脂(批号:160325)购自北京陆桥技术有限责任公司；胰蛋白大豆琼脂(批号:5355937)，伊红美蓝琼脂(EMB)(批号:5328983)，购自美国BD公司；革兰氏阴性细菌鉴定卡(GN)(批号:241390440)购自法国生物梅里埃公司。

2.3 主要仪器设备

HFsafe-1500 LC型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；GHP—9160型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；ZF-1B型三用紫外分析仪(上海汗诺仪器有限公司)；GR110DR型立式高压蒸汽灭菌器(美国ZEALWAY)；VITEK2 Compact全自动微生物鉴定/药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)；DM4B型leica数字显微镜(徠卡显微系统(上海)贸易有限公司广州分公司)。

2.4 检验方法

按照ACAS-PT208“生活饮用水微生物指标菌检测能力验证”作业指导书和GB/T 5750.12-2006[3]的要求进行发酵、分离和鉴定。同时，采用全自动微生物生化鉴定系统(VITEK2-Compact)进行菌株鉴定，综合以上试验结果出具报告。

2.5 操作步骤

菌落总数与大肠埃希菌均由两名实验员独立完成，按照GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》与GB/T 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》的要求进行。

2.5.1 样品水化

样品水化按照作业指导书说明进行。操作如下:样品需要用220 mL无菌水进行水化，首先待待测样品温度恢复至室温后，才可开启样品，开启后立即加入20 mL无菌水进行水化；待溶解后吸出，移入无菌瓶中，再用余下的无菌水清洗西林瓶内壁，回收清洗液移入上述无菌瓶中，此溶液即是待测水样样品。操作各环节应保证无菌和充分混匀。

2.5.2 菌落总数测定

以无菌操作的方式从2.5.1中制备的220 mL待测水样样品(100稀释液)中取出1 mL加入到9 mL灭菌生理盐水试管中，充分混匀成10-1稀释液，再从10-1稀释液中取出1 mL加入到9 mL灭菌生理盐水试管中，充分混匀成10-2稀释液，按同法依次稀释成10-3、10-4稀释液；从100～10-4每个稀释液中取出1mL分别加入到2个无菌平皿中，倾入约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋转平皿，充分混匀。待培养基凝固后倒置放入36℃培养箱培养；24 h后取出读数，再放回培养箱，48 h后再取出读数。稀释过程中制备每个稀释液都需要更换新的灭菌玻璃吸管，同时以生理盐水和营养琼脂培养基做空白对照。

2.5.3 大肠埃希菌检测(多管发酵法)

以无菌操作的方式从2.5.1中制备的220 mL待测水样样品(100稀释液)中取出10 mL接种到10 mL双料乳糖蛋白胨培养液中，再依次从100～10-4稀释液中取1 mL接种到10 mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释液接种5管。将接种管置于36℃培养箱内，培养24 h。如发酵产酸或产气，则用灭菌接种环将上述试管中的液体接种到EC-MUG管中。将已接种的EC-MUG管置于44.5℃培养箱内，培养24 h。再将培养后的EC-MUG管在暗处用波长366 nm，功率为6W的紫外灯照射。观察是否有荧光。同时用接种环取产气(无荧光)或有荧光的EC-MUG管1环，划线接种于EMB平板，于36℃培养箱内培养24 h。从EMB平板上选取典型菌落进行革兰氏染色、镜检。镜检符合的菌落再划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)平板，置于36℃培养箱内培养24 h。再进行IMViC试验[5]，同时取TSA上菌落，用GN鉴定卡，按照GN卡试剂说明书制备测试菌液，并于VITEK2-Compact菌种鉴定系统上进行系统的生化鉴定。

3 结果与分析

3.1 菌落总数

实验采用双人独立操作，稀释度范围选取了100～10-45个稀释度，结果见表1。两位实验员的样品检测结果基本一致，最终报告为16-R152:64 CFU/mL，16-M282:44 CFU/mL。Z值分别为:16-R152:-1.26，16-M282:-1.37，结果为满意。

表1 菌落总数结果(CFU/mL)

3.2 大肠埃希菌

实验选取了101～10-46个稀释度。结果见表2。最终报告为16-R152:350MPN/100mL，16-M282:〈2MPN/100mL。Z值分别为:16-R152:0.00，16-M282:满意，结果均为满意。

4 小结

4.1 检测准备阶段

4.1.1 人员和仪器的准备工作

(1)检测尽量安排两位或以上的检验员独立地进行检测。在检测开始前一定要先熟悉检验标准的每个细节。

(2)确保在检测过程中所需的每部仪器都在仪器校准的有效期内并且可以正常使用。

4.1.2 培养基、生化试剂和菌株的准备工作

(1)确保培养基和生化试剂在有效期内并且没有质量问题。培养基可以进行性能测试，生化试剂可以用阳性菌株和阴性菌株进行测试。培养基和生化试剂尽量现配现用，如不能马上使用的，要存放在适宜的环境中。在培养基配制过程中特别要注意试剂高压灭菌后的pH值是否在适合范围，如EC-MUG的pH值要在7～7.5[6]。接种前，各种培养基和生化试剂须预热到培养温度，避免样品接种后在升温过程中有杂菌生长，干扰结果判定。做好试剂空白，防止试剂问题影响实验。如果是商品化培养基或者培养基配制时间较早，需要提前1～2 d放入培养基，在接种温度下进行培养，观察无菌生长后方可使用。

(2)尽量使用有证的标准菌株，并在合适的环境中进行保存。在实验前进行活化并验证其质量是否存在问题。

4.2 检测阶段

4.2.1 接种方面的注意事项

(1)收到样品后仔细阅读作业指导书并严格按其说明进行操作，尽快开始检验。注意要耐心地对装有样品干粉的西林瓶进行多次润洗。保证无残留物在西林瓶内。

(2)使用磁力转子让样品保持均匀。接种的稀释度尽可能地多，确保有合适稀释度的菌落数在可计算范围内。在菌落总数方面，每一个稀释度可以接种多于2个平板，防止个别平板因蔓延或其他原因不能读数时，还可以保证读数的准确性。

(3)接种后尽快放入培养箱进行培养。

4.2.2 读数方面的注意事项

(1)对于菌落总数，每天都观察生长情况且预读一次，防止平板里有蔓延的菌落，干扰读数，影响结果。在最终读数时，可以一个平板多人读数，防止因个人的原因导致的漏读和错读。

(2)在大肠埃希菌方面，如果在观察乳糖蛋白胨和EC-MUG管时有可疑情况，可适当延迟培养时间，防止漏读一些发酵较慢的菌。观察EC-MUG荧光时也需要多人一起判定，防止一些荧光较弱的管被漏读。必须做阴阳菌株对照，有利于结果的判定。无论EC-MUG有无荧光，都划EMB和做后续的生化做为辅助判定。