五味子提取物抑菌效果研究

陈蔚燕

(青岛农业大学化学与药学院, 山东 青岛 266109)

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinen-sis( Turcz. ) Baill. 的干燥成熟果实, 其性酸、甘、温[1-3], 具有益气、敛肺、生津、止渴、止泻、敛汗、壮阳、补肾等功能[4-5]，关于五味子在对中枢神经系统起到镇静、催眠、抗惊厥方面的药理研究比较多[6-8]。五味子具有杀菌抑菌的作用，但研究主要集中在其对医学细菌的抑制活性方面[9-12]，关于其对农作物病原真菌的活性研究较少。目前农业上对植物病害的防治仍主要依靠化学杀菌剂，为了开发植物源农药，本文以五味子为试材，对其提取物进行抑菌活性研究，为五味子作为杀菌剂应用于农业提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 试剂与材料 五味子(青岛市同方大药房)，琼脂(国药集团化学试剂有限公司), 葡萄糖(天津市光复科技发展有限公司)，无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，丙酮(莱阳市康德化工有限公司)，乙酸乙酯(天津市大茂化学试剂厂)；柑橘炭疽病菌、棉花枯萎病菌、小麦全蚀病菌、白菜灰斑病菌、辣椒炭疽病菌等植物病原真菌的菌种均由山东省农业仿生应用工程技术研究中心提供，菌种使用前均进行复壮培养。

1. 2 仪器与设备 FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，250D恒温光照培养箱(常州市华普达教学仪器有限公司)，SW--CG--2FD型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，WD900B型微波炉(顺德市格兰仕微波电器有限公司)，101C-3型电热鼓风干燥箱(上海市实验仪器总厂)，RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-D循环水式真空泵(河南巩义市英峪豫华仪器厂)，电子分析天平(美特勒-托利多仪器上海有限公司)，XH-100A型微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)。

1.3方法

1.3.1 五味子索式提取法提取物的制备方法 将五味子烘干至恒重，粉碎，称取粉碎的五味子样品适量于250 mL 三颈烧瓶中, 加入适量的丙酮，置于索氏提取器上浸提。过滤得到上清液，合并上清液，得到五味子提取液，提取液经旋蒸浓缩干燥，得提取物，置于4℃冰箱保存，备用。

1.3.2 五味子微波正交提取法提取物的制备方法 称取粉碎的样品适量, 置于250 mL 三颈烧瓶中, 加入适量的萃取溶剂，并置于微波腔中, 装上冷凝管, 在MDS-8G型微波萃取系统中, 用相应的功率于适当的萃取时间和适当的萃取温度下进行微波萃取。萃取完成后，稍冷，旋蒸浓缩。按照如下设计的L9(34)正交实验进行，正交因素水平(表1)。

表1 正交因素水平表

1.3.3 菌丝生长速率法对抑菌效果的测定 采用菌丝生长速率法测定五味子提取物的抑菌活性。将提取物用移液枪移取一定的母液加入100 mL 培养基内配成相应浓度，每组实验均作对照。在超净工作台上把培养基倒入直径为 6 cm 或 7.5 cm的培养皿内制成含药平板备用，用接种针把打好孔的活化菌丝块接到制备好的培养皿内，每个处理重复3次，薄膜包好，放入恒温 27 ℃光照培养箱内培养 3 d 左右。待对照组 (CK) 里的菌饼长到培养皿 2/3 左右时，用十字交叉法测量各个菌落直径，计算各提取物的抑制率。

2 结果与分析

2.1 索式提取法五味子丙酮提取物抑菌效果 五味子丙酮提取物抑菌数据(表2)，从对各个病菌的抑菌率可以看出，随着五味子浓度的增大，抑菌率增大。其中对白菜灰斑病菌的抑制效果最好，在8.00 mg/mL时的抑菌活性达到88.64%。

表2 五味子丙酮提取物对5种不同病原菌的抑菌率(%)

2.2 不同提取条件对五味子提取物抑菌活性的影响 根据实验方案选用3水平4因素正交设计，五味子的乙醇、丙酮、乙酸乙酯微波提取液采取4.00 g/L浓度，测定其对棉花枯萎病菌的抑菌活性，实验结果(表3)。

表3 五味子微波提取物在4.00 g/L下对棉花枯萎病菌抑制活性正交设计表

注：试验号1-9指的是做了9次不同因素的实验

从表3可以看出五味子丙酮提取液在4.00 g/L浓度下对棉花枯萎病菌均有一定的抑菌作用。五味子丙酮提取液最高抑菌率约达69.9%。通过极差R分析，可以看出五味子提取物对真菌抑制最佳方案为：溶剂丙酮，功率400 W，样品与溶剂比5:70，反应时间5 min。

2.3 五味子微波提取物对小麦全蚀病菌的抑菌活性 取五味子的微波提取物加入灭菌的PDA培养基中，配制含药浓度梯度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、10 mg/mL的含药平板，采用上述的菌丝生长速率法测定抑菌活性，并求出对各菌种的EC50。五味子提取物对小麦全蚀病菌的抑菌作用(图1)。

图1 五味子对小麦全蚀病菌的抑菌数据图

从图1结果可以看出，五味子丙酮提取物对小麦全蚀病菌的抑制效果是随着浓度的增加而增加，五味子丙酮提取物对小麦全蚀病菌的有效抑制中浓度EC50为2.83 mg/mL，相关系数为0.970 8。

3 总结

本实验采用浸提法和正交试验微波方式对五味子进行了提取，并对其提取液进行了抑制病原真菌活性的实验，供试菌种为柑橘炭疽、小麦全蚀和棉花枯萎等几种真菌，从实验中测得索式提取法丙酮提取五味子提取液的抑菌活性，通过抑菌数据可知，在浸提法中五味子对5种植物病原真菌都有抑制作用，且随着五味子浓度的增大抑菌率增大。在微波提取中以萃取功率400 W，萃取时间5 min，样品与溶剂比5:70，溶剂为丙酮时为最佳提取工艺，同时求出了五味子提取液对小麦全蚀病原真菌的有效抑制中浓度。五味子的微波提取物对几种真菌具有抑菌效果，本实验与文献[13]中所描述的石菖蒲的微波抑菌效果相比，具有更高的抑菌率。本研究为五味子今后应用于农业和开发植物源农药杀菌剂提供了一定的指导意义。