乌司他丁对胃癌细胞生物学功能的影响

王新钊, 马丽娟, 孙淑君, 缪应业

解放军第152医院 1.消化内科； 2.肿瘤科； 3.临床实验室，河南 平顶山 467000

胃癌是全球性恶性肿瘤，发病率和死亡率较高，危害着人类的健康[1-2]。目前，胃癌的主要治疗方式是手术，但是已发生转移和预后不良仍造成胃癌患者的死亡率居高不下。肿瘤的发生、发展和转移是一个复杂的过程。近年来，临床上采用抗癌药物治疗各类肿瘤的作用越来越受到重视。乌司他丁是一种尿胰蛋白酶抑制剂，对多种蛋白酶的活性具有抑制作用，进而发挥抑制肿瘤生长和恶化的作用。研究[3-4]发现，乌司他丁主要通过作用于纤维蛋白酶激活因子、基质蛋白酶、血管内皮因子等，从而抑制肿瘤的生长和转移。目前国内关于乌司他丁对胃癌的作用机制研究较少。本研究采用了不同浓度的乌司他丁作用于体外培养的人胃癌MKN-45细胞，探讨乌司他丁对MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，以及对NF-κB信号通路的影响，以期为临床治疗胃癌提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1实验材料人胃癌细胞系MKN-45购自美国ATCC，乌司他丁购自广东天普生化有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰酶(含EDTA)购自美国Hyelone公司，Matrigel胶购自美国BD公司，四甲基偶氮唑(MTT)细胞增殖检测试剂盒、二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)、膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司，Transwell小室购自美国Corning公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜购自美国Pierce公司，β肌动蛋白(β-actin)抗体、核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自美国Abcam公司，B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司。流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司。

1.2细胞的培养与处理所有MKN-45细胞培养于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基，并加入质量浓度为10 g/L的青-链霉素，于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中，2 d换液一次，待浓度达到80%，采用质量浓度为2.5 g/L的胰酶消化进行传代。取对数期细胞加入不同浓度乌司他丁(400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml)进行处理，实验分为对照组、400 U/ml组、800 U/ml组、1 600 U/ml组，对照组加入等量的生理盐水。

1.3细胞增殖实验采用MTT法检测各组细胞的增殖能力。将细胞密度调整5×104ml-1接种于96孔板上，按照上述方法加入不同浓度乌司他丁进行处理，加入200 μl培养基，于37 ℃培养箱中培养48 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，37 ℃继续培养4 h；弃去孔内溶液，每孔加入150 μl DMSO，酶标仪中检测490 nm波长下细胞的吸光(OD)值。

1.4细胞凋亡实验将细胞浓度调整为1×106ml-1，培养24 h后，每孔加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光，4 ℃染色15 min，流式细胞仪进行检测。每孔设置5个平行孔，实验重复3次，取平均值。

1.5细胞侵袭实验将-80 ℃冰箱中的Matrigel胶置于4 ℃冰箱中融化，与300 μl无血清培养基混合均匀，吸取100 μl加入Transwell上室，37 ℃孵育5 h。收集各组细胞，计数，调整为5×105ml-1，吸取100 μl细胞悬液加入上室上孔，下室加入500 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养基，37 ℃培养24 h；PBS清洗上室，弃去残留液体，湿棉签擦去剩余细胞和Matrigel胶，多聚甲醛固定30 min，500 μl质量浓度为1 g/L结晶紫染色，37 ℃孵育30 min，显微镜下拍照、计数，取5个区域的平均值。

1.6检测细胞中NF-κB信号通路相关蛋白水平的变化弃去培养液，加入预冷的PBS液清洗3次，加入400 μl裂解液，4 ℃，12 000×g，离心15～20 min，吸取上清至无菌的EP管中。按照说明书配置相应浓度的分离胶和浓缩胶，注入分离胶凝固30 min，加蒸馏水进行封闭；弃去表面水分，加入浓缩较，插入梳子。吸取适量蛋白样品与4倍体积的上样缓冲液混合，煮沸10 min，12 000×g离心5 min，保存于-20 ℃冰箱中。将灌注好的聚丙烯酰胺凝胶置于电泳槽，加入电泳液，吸取30 μl蛋白样品加入上样孔，电压为80 V，待条带至分界线处，调整电压100 V，电泳至条带彻底分离，切断电源。切下所需胶条，浸泡于电转缓冲液中，将PVDF膜轻泡在甲醛中2 min，然后电转缓冲液中处理15 min；打开夹子，依次放入海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，冰浴中250 mA转膜50 min；于质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉中封闭1 h；加入一抗与PVDF膜4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min；加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min，避光，加入ECL工作液，凝胶成像系统中记录光密度值，Quantity One分析与内参β-actin的比值。

2 结果

2.1乌司他丁对MKN-45细胞增殖的影响采用MTT实验检测不同浓度乌司他丁对胃癌MKN-45细胞增殖的影响，结果如表1所示，与对照组相比，不同浓度乌司他丁对胃癌MKN-45细胞增殖均具有显著的抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)；与400 U/ml组相比，800 U/ml组、1 600 U/ml组细胞的增殖显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与800 U/ml组相比，1 600 U/ml组细胞的增殖差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 乌司他丁对MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭的影响Tab 1 The effect of Ulinastatin on proliferation, apoptosis, and invasion of MKN-45 n=3)

注：与对照组相比，aP<0.05；与400 U/ml组相比，bP<0.05。

2.2乌司他丁对MKN-45细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测不同浓度乌司他丁对胃癌MKN-45细胞凋亡的影响，结果如表1、图1所示，与对照组相比，不同浓度乌司他丁均显著促进胃癌MKN-45细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)；与400 U/ml组相比，800 U/ml组、1 600 U/ml组细胞的凋亡率显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与800 U/ml组相比，1 600 U/ml组细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 乌司他丁对MKN-45细胞凋亡的影响Fig1 The effect of Ulinastatin on apoptosis of MKN-45 cells

2.3乌司他丁对MKN-45细胞侵袭的影响采用Transwell实验检测不同浓度乌司他丁对胃癌MKN-45细胞侵袭的影响，结果如表1所示，与对照组相比，不同浓度乌司他丁均显著抑制胃癌MKN-45细胞侵袭,差异有统计学意义(P<0.05)；与400 U/ml组相比，800 U/ml组、1 600 U/ml组细胞的侵袭数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与800 U/ml组相比，1 600 U/ml组细胞的侵袭数差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4乌司他丁对MKN-45细胞中NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响采用Western blotting实验检测不同浓度乌司他丁对胃癌MKN-45细胞中NF-κB信号通路的影响，结果如表2、图2所示，与对照组相比，不同浓度乌司他丁均显著抑制NF-κB p65、Bcl-2蛋白水平，Bax蛋白表达量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与400 U/ml组相比，800 U/ml组、1 600 U/ml组细胞NF-κB p65、Bcl-2显著降低，Bax蛋白显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与800 U/ml组相比，1 600 U/ml组细胞的NF-κB p65、Bcl-2蛋白水平明显降低，Bax蛋白明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 乌司他丁对MKN-45细胞中NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响Fig 2 The effect of Ulinastatin on NF-κB signaling pathway related protein levels in MKN-45 cells

组别NF-κB p65Bcl-2Bax对照组1.125±0.2170.894±0.0920.345±0.048400 U/ml组0.863±0.086a0.674±0.065a0.527±0.056a800 U/ml组0.532±0.058ab0.369±0.038ab0.865±0.078ab1 600 U/ml组0.387±0.041abc0.213±0.024abc1.246±0.219abc

注：与对照组相比，aP<0.05；与400 U/ml组相比，bP<0.05；与800 U/ml组相比，cP<0.05。

3 讨论

乌司他丁是一种包含143个氨基酸的蛋白酶抑制剂，能够抑制多种蛋白酶、糖和脂类水解酶的活性，能够清除机体内的氧自由基、抑制炎性因子的水平以及稳定溶酶体膜等多种作用。目前，临床上常采用乌司他丁治疗急性胰腺炎、改善患者的免疫状态等。但研究[5-6]发现，乌司他丁对肿瘤的生长、转移具有较好的抑制作用。在乳腺癌中，乌司他丁可通过抑制基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的活性，从而抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭等[7]。另外，乌司他丁还可抑制肺癌细胞的生长、侵袭，但其具体的作用机制尚不清楚[8]。研究[9]发现，乌司他丁可作用于细胞中的透明质酸酶、乙酰肝素酶和影响细胞黏附因子相关蛋白的表达，从而发挥肿瘤的抑制作用。

本研究采用体外培养人胃癌MKN-45细胞，观察了400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml的乌司他丁对MKN-45细胞增殖、凋亡、侵袭以及NF-κB信号通路的影响。MTT结果发现,与对照组相比，乌司他丁显著抑制胃癌细胞的增殖。随着浓度的增加，800 U/ml与1 600 U/ml乌司他丁对细胞的增殖能力无显著影响，推断乌司他丁浓度为800 U/ml可能为体外较适宜的药物浓度，Transwell小室法结果显示，乌司他丁可抑制胃癌MKN-45细胞的侵袭能力。随着浓度的增加，800 U/ml乌司他丁与1 600 U/ml乌司他丁间差异无统计学意义，进一步证实800 U/ml乌司他丁为体外实验较适宜的浓度。

近年来，对药物诱导肿瘤细胞凋亡作用的相关研究成为热点。Bcl-2家族成员是细胞凋亡过程的重要调节因子，主要包括Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)[10]。Bcl-2与Bax形成同源二聚体或异源二聚体，从而调控细胞的凋亡。Bcl-2表达量增加可能是由于肿瘤细胞对化疗药物具有一定抵抗作用，从而促进细胞的生长[11]。本实验结果显示，乌司他丁能显著促进胃癌MKN-45细胞的凋亡、下调Bcl-2蛋白水平、上调Bax蛋白的表达量，随着浓度的增加，Bcl-2逐渐降低，Bax逐渐增加。NF-κB信号通路参与肿瘤细胞的生长、分化、转移等生物学功能，是目前研究抗肿瘤药物的潜在靶点之一[12]。p65是组成NF-κB蛋白的主要成员，在细胞质中以二聚体的形式与核因子抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)结合，抑制IκB酶的活性。当机体受到肿瘤刺激、炎症刺激以及其他刺激等，该复合物被激活，在细胞核中调控细胞的生长、分化以及侵袭、迁移功能[13]。本实验结果还发现，乌司他丁显著抑制NF-κB信号通路的表达。与前人的研究[14]结果一致，乌司他丁通过抑制NF-κB信号通路活性阻碍乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、诱导其凋亡，并抑制裸鼠移植瘤的生长。表明乌司他丁抑制胃癌MKN-45细胞增殖、促进其凋亡，其作用机制可能与NF-κB信号通路有关。

综上所述，乌司他丁抑制胃癌MKN-45细胞的增殖是通过调控NF-κB信号通路诱导细胞凋亡，抑制其侵袭，为乌司他丁作为抗肿瘤生长、侵袭的新药提供新思路，而NF-κB信号通路可能是治疗胃癌的潜在靶点。