乳与乳制品中雌激素含量测定方法

张建荣 / 通标标准技术服务上海有限公司

0 引言

日常生活中，人们所食用的动物性食品，包括动物肌肉（猪、牛、鸡肉）、动物肝脏、脂肪、鸡蛋等，当然也包括牛奶和各种奶制品（奶粉、奶酪、奶油等），都是含有微量激素的食品。这些食品中所含雌激素主要是内源性雌激素，主要包括雌酮、β-雌二醇、雌三醇，其中β-雌二醇的活性最强，对其检测具有一定的代表性；另外还可能有人为添加的，属于人工合成的外源性雌激素，最具代表性的是二苯乙烯类合成雌激素，主要有己烯雌酚，己二烯雌酚，己烷雌酚等，它们可以进入动物体内，通过干扰动物体内源性雌激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体内源性雌激素的作用[1]。

由于有人将雌激素用于养殖业以促进动物生长，如果人们长期食用这种激素含量较高的动物产品，会导致产生诸如儿童性早熟、成年人癌症等负面影响，因此应严格控制食品中雌激素的含量[2]。

而己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚都属于人工合成的雌性激素，是1，2-二苯乙烯类化合物，具有促进动物生长的特性。它能促进动物体内蛋白质的合成代谢，提高动物日增重量，提高饲料效率。因此，其一直作为生长促进剂用在猪、羊、牛、鸡等畜禽的饲养过程中。但现已证实这些人工合成的雌性激素可在动物的肝脏、肌肉中残留，从而能诱发动物和人的白血病、子宫癌等疾病[3]。因此，早在1988年1月1日欧盟就发出了禁止使用促生长人工合成激素，并对其按残留指令（86/469/EEC）实行监控。人工合成激素在欧、美等国家已被禁用。我国农业部也于1988年6月30日发布了《兽药管理条例实施细则》，并于1998年进行了修订。然而，由于后来发现的多种可促进动物生长的代用物的效力都远不如己烯雌酚，以致使己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚特别是己烯雌酚等人工合成的雌性激素在动物生产过程中的使用禁而不止。因此建立准确可靠的动物源性食品中雌激素残留检测方法至关重要[4]。

目前动物源食品中雌激素残留的检测，最广泛使用的是气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、免疫分析法、生物传感器法等[2]。由于动物性食品中雌激素残留物水平很低，样品基质复杂，干扰物质多，所以对于残留分析技术的要求甚高。通过文献查找发现液相色谱-质谱联用技术对复杂基体中微量待测物的测定比较有效。质谱分析的基本原理是使所研究的混合物或单体形成离子，然后使形成的离子按质量，确切地讲按质荷比M/Z进行分离。质谱检测器可以检测多种样品，且具有高灵敏度，可以获得不同于常规HPLC检测器的大量而丰富的结构信息。然而，尽管质谱常常可以得到化合物分子离子及碎片的信息，但混合物的质谱解析往往难以实现。液相色谱与质谱联用，可以首先将混合物分离为单一组分，之后再用质谱检测器进行检测。如此过程不仅可以得到更有意义的质谱数据，而且可以在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，优化质谱检测信号[5]。

因此，本文将采用液相色谱-质谱联用的方法来测定激素残留量，这种试验方法准确度高,重现性好，操作快速简便，一般可以满足动物源食品中测定激素残留量的需要。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

1.1.1 串联四级杆液质联用仪：ABI API4000（配备ESI源）、Agilent 1200液相色谱系统：液相系统包括自动进样器和四元梯度泵。软件使用Analyst 1.4.1版。

1.2 试剂

1.2.1 溶液

1）0.2 mol/L醋酸铵缓冲液（pH 5.2±0.2）：15.4 g 醋酸铵溶解于900 mL水中，用冰醋酸调节pH，使其至pH 5.2 ±0.2 ，用水定容至1 L，有效期为3个月。

2）β-葡糖醛酸糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶（β-glucuronidase/arylsulfatase）：4.5 U/mL β- 葡 糖 醛酸糖醛酸酶，14 U/mL芳香基硫酸酯酶[5]。

3）洗脱液： 取70 mL二氯甲烷加30 mL甲醇，混匀。

4）定容液：乙腈∶水（1∶1），溶解混匀。

5）己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚、雌二醇和雌酮单标标准储备液（1.0 mg/mL）：分别准确称取10.0 mg标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.0 mg/mL的标准储备液。根据需要再用甲醇将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作溶液[5]。

6）己烯雌酚-d8、雌二醇-13C2单标内标储备液（1.0 mg/mL）：准确称取10.0 mg同位素标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.0 mg/mL的标准储备液。根据需要再用甲醇将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作溶液。

7）己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚、雌二醇和雌酮单标标准工作液（1.0 μg/mL）：分别取1.0 mg/mL的单标标准储备液10 μL，稀释定容至10 mL，于-4 ℃下低温保存[5]。

8）己烯雌酚-d8、雌二醇-13C2单标内标工作液（1.0 μg/mL）：取1.0 mg/mL的单标内标标准储备液10 μL，稀释定容至10 mL，于-4 ℃下低温保存[5]。

1.3 实验方法

1.3.1 称样酶解

各称取5 g样品（准确至0.01 g）于50 mL 具盖离心管中，加入10 mL醋酸铵缓冲溶液（pH 5.2，0.02 moL/L），再加入25 μL酶液，漩涡混匀，于37 ℃恒温水温箱过夜，振荡酶解12 h。

1.3.2 提取

将上述样品取出放置至室温后，分别加入20 μL内标工作溶液，再加入30 mL乙腈提取液，振荡提取5 min。于4 500 r/min离心5 min，吸取上清液于250 mL的梨形瓶中。

1.3.3 浓缩

打开旋转蒸发仪，设置转速115 r/min，水温40 ℃，压强90 mPa，去除乙腈近2 mL后，加10 mL蒸馏水，涡旋振荡，溶液待净化。

1.3.4 固相萃取净化

活化：用6 mL二氯甲烷∶甲醇（7∶3，体积比）、6 mL甲醇、6 mL水活化ENVI-CARB固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

用6 mL二氯甲烷∶甲醇（7∶3，体积比）活化氨基柱。

上样：提取液以1滴/s的速度从ENVI-CARB柱流出。

淋洗：先用3 mL水淋洗，减压抽干；后用3 mL正己烷淋洗，抽干，将杂质去除。

洗脱：将活化好的氨基柱串接在ENVI-CARB固相萃取柱下方，用6 mL的二氯甲烷∶甲醇（7∶3，体积比）洗脱，去掉ENVI-CARB柱，再用3 mL的二氯甲烷∶甲醇（7∶3，体积比）洗脱氨基柱，收集洗脱液。

1.3.5 浓缩

将收集完的洗脱液在40 ℃水温、微弱的氮气流下吹干。

1.3.6 定容

用1 mL乙腈∶水（1∶1）溶解残渣，涡旋振荡1 min，再用1 mL针筒吸取溶解液，过有机相滤膜，装入进样小瓶中，供液质联用仪器测定。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

本实验采用了β-葡糖醛酸糖醛酸酶酶解样品，达到了将动物组织中蛋白质消解，使被测物从细胞中的蛋白质结合状态下（非共价蛋白质键合物）游离出来的目的。

另外在提取过程中，通过反复试验，最终采取乙腈作为提取液，而非一般所用的甲醇提取液。这是因为乳与乳制品中蛋白较多，如果提取过程中不能将大量蛋白去除，将在净化过程中引起固相萃取小柱的堵塞，由于乙腈溶液沉淀蛋白质的效果要优于甲醇，因此采用乙腈提取可获得满意的效果。

本文正是通过对不同基质的样品的加标回收来验证采用β-葡糖醛酸糖醛酸酶酶解样品和使用乙腈作为提取液的方法的显著优越性。

由于样品的基质抑制效应非常明显，因此样品的净化步骤非常重要，样品净化程度好可大大提高检测的灵敏度。通过本方法的验证,本实验所采用的净化方式能提供一个可靠的净化效果。

2.2 检测手段的选择

一般选择气相色谱法、气相色谱-质谱联用法，只能分离分析极性小和对热稳定的化合物，而液相色谱法在通用性和灵敏度上不如液相色谱-质谱联用法，其他方法有的试剂用量多，有的操作复杂、花费时间长，有的不宜准确定量[6]。

而液相色谱-质谱联用技术解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点, 对复杂基体中微量待测物进行测定，可以做到在复杂样本体系中进行目标化合物的快速定量,而且简化了试验步骤, 大大节省了工作量，提高了效率, 特别适合于亲水性强、挥发性强的有机物, 热不稳定化合物及生物大分子的分离分析。同时该检测方法的灵敏度与精密度均符合对雌激素残留检测的需求[7][8]。

在分析过程中发现，合成苯二烯类合成雌激素的响应值较高，而雌二醇的响应值最低，如果流动相只用乙腈和水，则雌二醇的最低检出限很难达到1 μg/kg。由于分析雌激素的质谱电离模式采用的是负模式，因此向流动相中添加适量的氨水，以促进化合物的离子化，从而达到了理想的丰度。

2.3 仪器参数的优化

2.3.1 液相色谱测定条件[9]

色谱柱：CNW Athena C18-WP 2.1 mm×150 mm，5 μm；流动相：A：水，B：乙腈+0.1% 氨水（加入氨水可促进离子化）；洗脱梯度：见表1；流速：0.3 mL/min；进样体积：30 μL。

表1 雌激素梯度洗脱条件

2.3.2 质谱测定条件

电离化方式：电喷雾离子化（ESI）；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；离子源温度 ：450 ℃；雾化气压强：60× 6.894 757 kPa；气帘气压强：30× 6.894 757 kPa；辅助气压强：60×6.894 757 kPa；电喷雾电压：-4 500 V；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压，见表2。

表2 目标物的母离子、子离子及EP、DP、CE、CXP电压值

2.4 方法的线性回归曲线方程

根据上述实验条件，将己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚、雌二醇和雌酮标准溶液系列等体积进样，以目标物峰面积乘内标物浓度和内标的峰面积比值为纵坐标，以目标物浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算相关系数。每个化合物的曲线方程及相关系数见表3，得到可接受的标准曲线相关系数的最低值为0.99。

表3 化合物的曲线方程及相关系数

2.5 方法的回收率和精密度

以不含雌二醇、雌酮、己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚和雌酮的牛奶、奶酪、炼乳、奶粉为空白样品，分别按1.0、2.0、5.0 μg/kg三个水平做添加回收实验和精密度实验，每种基质每个水平做6个平行实验，其回收率和精密度数据见表4～7。

表4 牛奶

表5 奶酪

从表4～7中看到，目标物的回收率及精密度结果均能够满足残留分析检测的需求。本实验的测定低限均为1 μg/kg。在线性范围内可接受的回收率平均范围为60%～105%，精密度（相对标准偏差）为≤20%。其中雌二醇回收率范围在68.0%～102.0%，相对标准偏差在2.9%～14.3%；己烷雌酚的回收率范围在67.5%～104.4%，相对标准偏差在6.42%～12.3%；己烯雌酚回收率范围在59.2%～105.0%，相对标准偏差在5.07%～16.3%；双烯雌酚的回收率范围在67.4%～105.0%，相对标准偏差在3.72%～14.2%；雌酮的回收率范围在67.4%～104.4%，相对标准偏差在3.72%～16.3%。

表6 炼乳

表7 奶粉

2.6 定性测定

每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子。在相同实验条件下，样品中待测物质保留时间，与混合标准溶液中对应的相对保留时间偏差在±2.5%之内，各目标物的保留时间为雌二醇（5.22 min）、己烷雌酚（6.04 min）、己烯雌酚（6.36 min）、双烯雌酚（6.49 min）、雌酮（3.71 min）；与样品谱图中各组分定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表5规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表5 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差/%

2.7 定量测定

在最佳工作条件下，混合标准溶液分别进样，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用内标法进行定量测定，由于样品的基质抑制效应非常明显，因此同位素内标方法是非常好的校正方法。其作用在于可监测回收率、作为保留时间校正物或色谱参考物[10]。其中雌二醇以雌二醇同位素内标，其他三个外源性激素以己烯雌酚同位素为内标。样品溶液中待测物的响应值应在工作曲线范围内。

2.8 结果计算

如样品中含有雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚、雌酮，即满足定性标准条件，可用数据处理机，或按式（1）计算试样中待测物的含量：

式中：Xi—— 试样中目标物的含量，μg/kg；

c—— 从标准曲线得到的目标物溶液浓度，ng/mL；

V—— 样液最终定容体积， mL；

m—— 最终样液所代表的量，g

3 结语

本实验结合液相色谱与质谱检测器联用技术的特点，建立了有效的LC-MS/MS测定乳与乳制品中雌激素残留量的方法。通过前处理将样品浓缩提纯，从而使检测灵敏度提高，减小了干扰峰对目标峰的影响。经过前处理的样品在检测器最佳色谱条件下对食品中残留的雌二醇、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚、雌酮进行测定。经实验分析，该方法线性关系良好，最小检出浓度、回收率及精密度等均符合标准方法的研制要求，因此本方法可行性较强，便于推广使用。