不同鸡品种BTN2基因SNP和INDEL分析

王统苗，郑圣晗，张 莘，陈博雯，刘本帅，张 扬，王志秀，常国斌，陈国宏

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC），是大部分脊椎动物基因组中的一个基因家族，与免疫系统密切相关[1]。在鸡中分为MHC-B复合体和MHC-Y复合体两部分[2]。鸡的MHC-B复合体包含了经典I类和II类两个位点。BTN2（B-butyrophilin 2）基因是MHC-B复合体中的典型基因座[3]。有研究表明MHC基因多态性与传染性疾病的遗传抗性高度相关[4]，MHC基因家族中BTN2基因在鸡或火鸡中很少表达，鉴定MHC-B在鸡中的表达模式，能够验证BTN2基因功能并提供MHC转录的组织特异性表达谱，这些表达谱可以作为未来免疫学研究的资源[5]。

R.Kama等[6]发现BTN2基因能够在酵母中介导高尔基体蛋白分选，同时发现酵母BTN2基因与Hook1具有相似性，Hook1是与哺乳动物细胞中的细胞骨架相关的卷曲螺旋蛋白。正常水平的BTN2蛋白可以治愈大多数新形成的朊病毒变种。在人的MHC家族中BTN2是免疫球蛋白基因，能够在所研究的所有组织中广泛表达，但处于低转录水平[7]。

我国拥有丰富的地方鸡资源，如狼山鸡、仙居鸡等，其优质性状明显、抗逆性强，因此研究并发现一些抗病基因具有重要意义。本实验选取26个优良鸡种，并对其BTN2基因进行目标捕获测序，筛选出BTN2基因的SNP和INDEL位点，最后建立系统发育树种探究不同地方鸡种的同源性，以研究BTN2基因的遗传多样性，为鸡的免疫和抗病育种研究提供候选基因。

1 材料和方法

1.1 鸡品种来源及基因组DNA提取

本研究共采集26个鸡品种：其中广西黄鸡（GXH）、绿壳蛋鸡（LK）、隐性白羽鸡（YB）、太湖鸡（TH）、如皋鸡（RG）、文昌鸡（WC）、雪山草鸡（XC）、SPF-来航鸡（LH）、安卡鸡（AK）、AA 鸡（AA）、溧阳鸡（LY）、罗斯鸡（LS）、青脚麻鸡（QJ）等 13个鸡种来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室禽种资源基因库，茶花鸡（CH）、北京油鸡（YJ）、乌骨鸡（WG）、萧山鸡（XS）、河南斗鸡（DJ）、黑狼山鸡（HL）、藏鸡（ZJ）、仙居鸡（XJ）、固始鸡（GS）、大骨鸡（DG）、鹿苑鸡（LuY）、白耳鸡（BE）等12个鸡种来自中国农业科学研究院家禽科学研究所，红色原鸡（HY）采集自云南省野生动物救护中心。每个鸡种随机取10个样，采集翅静脉血液2 mL，然后放入含肝素钠的采血管中，加入裂解液，在4℃下保存，采用酚-氯仿抽提法提取DNA[8]。

1.2 BTN2基因序列对比分析与构建系统发育进化树

将所提取的DNA样品送至深圳华大基因公司进行目标捕获测序，获得序列，并以NCBI（National Center of Biotechnology Information）中原鸡（Gallus gallus）序列为参照序列，并用MEGA6软件对26个鸡种进行比对分析，统计BTN2基因的SNP位点和INDEL位点以及氨基酸的改变，最后运用MEGA6软件构建系统发育进化树（phylogenetic tree）。

2 结果与分析

2.1 不同鸡品种 BTN2基因的 SNP位点和Indel位点分析

鸡BTN2基因的多态性主要在外显子上表现，本研究以NCBI中原鸡（Gallus gallus）的BTN2基因外显子位点为参考，用MEGA6软件对不同鸡种碱基序列进行比对分析。由表1可知，26个鸡种中BTN2基因上共有152个SNP和INDEL。

2.2 不同鸡品种BTN2基因的Exon上SNP位点和氨基酸变化

如表2所示，在26个鸡种中BTN2基因外显子中筛选出27个SNP位点，主要发生在Exon8上，其中来航鸡和雪山草鸡在3个位点都发生了突变，茶花鸡在138 985位点发生的A/C、雪山草鸡在138 970位点发生的C/A、SPF-来航鸡在137 201位点发生的T/C、太湖鸡在137 201位点发生的T/C引起的氨基酸变化为同义突变，其他相应氨基酸均为错义突变。白耳鸡、广西黄鸡、乌骨鸡、大骨鸡、萧山鸡、黑狼山鸡在外显子上没有SNP。结果表明，BTN2基因Exon8以及相应的氨基酸的多态性表现出一定的遗传多样性。在 Exon1、Exon3、Exon5、Exon7 没有SNP，说明这几个外显子具有高度的保守性。

2.3 不同鸡品种BTN2基因的Intron上SNP位点

为了进一步探究BTN2基因中的碱基的多态性，本研究以Gallus gallus的BTN2基因内含子为参考，采用MEGA6软件对鸡种碱基序列进行分析比对，结果显示16个鸡种中BTN2基因内含子有48个SNP位点；只有Intron5有一个INDEL位点；16个地方鸡种的BTN2基因内含子发生的SNP见表3。

表1 不同鸡品种BTN2基因外显子和内含子上SNP和INDEL的分布情况Table1 Distribution of SNP and INDEL on exons and introns of BTN2 gene in different chicken breeds

表2 不同鸡品种BTN2基因外显子上SNP位点分布Table2 Distribution of SNP in BTN2 gene of different chicken breeds

2.4 不同鸡品种BTN2基因的INDEL位点

由表4可知，BTN2基因的插入缺失多发生在外显子上，且大多数鸡品种INDEL序列基本一致。斗鸡、绿壳蛋鸡、如皋鸡、雪山草鸡、北京油鸡在138 264～138 990位点上既发生插入又发生缺失，且插入的碱基序列都为T，缺失的序列为CAACA。广西黄鸡、乌骨鸡在同一位点插入碱基T，黑狼山鸡和白耳鸡没有发生INDEL。国外鸡品种AA鸡、安卡鸡、罗斯鸡、隐性白羽肉鸡都插入碱基序列A。一些国内鸡品种，如茶花鸡、太湖鸡、藏鸡也在同一位点插入碱基序列A。所以国内外鸡种的INDEL并无明显差异。

表3 不同鸡品种BTN2基因内含子上SNP位点分布Table3 Distribution of SNPs in introns of BTN2 gene in different chicken breeds

2.5 不同鸡品种BTN2基因系统进化树分析

不同鸡种BTN2基因具有一定的多态性，为了进一步探究不同鸡种BTN2基因同源性，我们用MEGA6 软件，使用 NJ（neighbour-joining）法构建系统发育进化树。由图1可知26个鸡种分为3大类：文昌鸡、SPF-来航鸡、太湖鸡、萧山鸡等聚为一类，他们都具有耐粗饲、适应性强等特点；溧阳鸡、北京油鸡、如皋鸡等聚为一类，他们都具有肉质鲜美等优点；茶花鸡、仙居鸡、固始鸡、大骨鸡等聚为一类，他们具有生长速度快、抗病性强等特点。上述结果显示，不同鸡品种BTN2基因在进化过程中有丰富的遗传多样性。

3 讨论

BTN2基因属于MHC家族成员之一。该基因与抗病力有关，在鸡的抗病育种中具有较为重要的意义[9]。M.S.Monson等[5]发现BTN2基因主要在鸡的肌肉组织中表达，在法氏囊和脾脏中表达有限。该研究同时表明MHC具有免疫应答的重要功能，许多MHC-B基因也参与适应性或先天性免疫，但其他一些则具有非免疫或未知功能。以前MHC-B基因研究一般只关注于几个基因或组织，对于其在鸡上的具体功能还不完全明确。因此通过对比不同鸡种的基因序列，分析BTN2基因在不同鸡种中发生的突变和插入缺失，对研究MHC-B在鸡的肌肉组织中的具体作用至关重要。

本研究发现BTN2基因在不同鸡品种之间存在着多处SNP和INDEL位点，发生在外显子的SNP位点有27个。同时发现外显子的SNP多发生在Exon8上，由此可以看出第8外显子在BTN2基因中起决定性作用，决定着BTN2基因的遗传多样性。本研究同时发现有18个鸡种在第8外显子上都有A/C的突变。内含子上的SNP位点有48个，近年来，人们认为内含子有许多新的功能，如维持染色体的特定结构等。此外内含子在转录和转录后水平对基因的表达起调控作用[10]。安卡鸡、白耳鸡、斗鸡、广西黄鸡、SPF-来航鸡、溧阳鸡、青脚麻鸡、如皋鸡、太湖鸡、文昌鸡在内含子上各具有3个SNP位点，这可能间接说明BTN2基因具有丰富的遗传多样性。白耳鸡、萧山鸡、广西黄鸡和乌骨鸡外显子没有SNP位点，同时在系统聚类图上聚为一类，这可能是因为这四种鸡的适应能力强，抗病能力强。黑狼山鸡和白耳鸡在外显子上既没有SNP也没有INDEL，这可能与这两个鸡种抗病性弱有关。张娇等[11]的研究结果与本实验发现的结果一致。19个鸡种中有64%在第8外显子的138 978和138 969位点有A/C突变，其中AA鸡、安卡鸡、来航鸡、溧阳鸡、青脚麻鸡、罗斯鸡、文昌鸡、隐性白羽鸡、藏鸡都在138 978位点有A/C突变，这一位点可作为BTN2基因有关抗病性的候选SNP位点。茶花鸡、SPF-来航鸡虽然发生了A/C的单碱基替换突变，但这个位点的碱基突变并未引起氨基酸变异，属于同义突变。不同鸡品种BTN2基因遗传变异更加丰富，真实反映了不同鸡品种先天免疫基因资源丰富、适应性强的特点[12]。

表4 不同鸡品种BTN2基因的INDEL分布Table4 INDEL distribution of BTN2 gene in different chicken breeds

图1 不同鸡种系统进化树（Bootstrap=1 000）Figure1 Phylogenetic tree of different breeds （Bootstrap=1 000）

在本研究的系统聚类图中，北京油鸡和斗鸡聚为一类，北京油鸡的原产地主要集中在北京城近郊一带，斗鸡主要集中于河南，这两个品种具有地理分布相近，生产速度缓慢等共同特点。聚类分析图显示，其他鸡品种和茶花鸡的同源性较低，茶花鸡单独分为一小类。这可能由于历史原因造成的。茶花鸡产于云南省，由于历史上该地区相对比较封闭，与外来血缘交换较少，长期处于闭锁繁衍并自然形成此优良品种[13]。同时我们发现茶花鸡在外显子和内含子上都有SNP，说明茶花鸡具有丰富的遗传多样性，这与张廷钦等[14]利用血液蛋白及同工酶分析的结果一致。茶花鸡的遗传多样性较高，主要有两方面的可能原因：一是该鸡种饲养粗放，育种目标不清晰，较低的人工选择强度，属选育程度较低的地方品种[15]；二是该鸡种与红色原鸡长期以来有一定的基因交流[16]。SPF-来航鸡和太湖鸡聚为一类，且他们发生的SNP为同一个碱基序列，虽然地理距离较远，但是他们可能曾经发生过血缘交流。国外品种AA鸡、隐性白羽肉鸡和罗斯鸡聚为一类，并且它们之间的同源性较高，这一结果和鸡群体的育种历史和地理分布基本一致[17]。

综上，BTN2基因在国内外鸡品种中存在多种遗传变异，尤其在中国地方鸡品种中表现出极其丰富的遗传多样性，可为中国地方鸡品种优良的先天免疫性能的遗传机制相关研究提供重要参考。然而，尽管本研究筛选出有关抗病特征的候选SNP位点，尚需进一步研究以确定其能否对传染性疾病产生抗性。