染色体断裂实验联合基因突变检测在范可尼贫血诊断中的应用

陈万紫，陈加弟，黄慧芳

范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）是一种常染色体或X连锁的隐性遗传性疾病，为最常见的遗传性骨髓衰竭综合征，其发病率为1／106～5／106，基因携带率为1／300，临床表现主要有多样化先天畸形、进行性骨髓衰竭、皮肤黏膜色素沉着和易发恶性肿瘤等［1－3］。细胞染色体断裂实验是诊断FA的经典方法，但是存在诊断周期长、细胞培养及染色体制备有失败风险等缺点；且FA嵌合患者对丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）不敏感，可使染色体断裂实验出现假阴性，所以染色体断裂实验对体细胞嵌合FA患者常不适用，因此分子检测对FA的诊断显得尤其重要。以往常采用FA各相关基因外显子测序及与多重连接探针扩增技术相结合或Western－blot、免疫沉淀法、逆转录PCR等方法对FA进行突变检测［4］。这些方法虽也能有效检测蛋白表达、点突变和大片段缺失／插入，但常需多种方法联合使用，操作繁琐，耗时长。二代测序技术因其高通量、高准确性及高速度等特点，已越来越多地应用于临床诊断中［5］。本实验采用二代测序联合染色体断裂实验对2例疑似FA的患儿及其父母进行5种常见FA相关基因突变的检测，报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2015年就诊于血液科的患儿2例。患儿1，女，3岁，以“血小板减少”为主诉就诊。贫血面容，全身皮肤黏膜苍白，可见陈旧性瘀点、瘀斑，未见其他明显色素沉着。血常规示：白细胞3.60×109L－1，中性粒细胞0.87×109L－1，血红蛋白46g／L，血小板14×109L－1。生化检查、B超、X线拍片均未显示异常，Coombs实验阴性，抗血小板抗体阴性。骨髓形态学检查：有核细胞增生减低，粒系略减低，红系增生减低，全片巨核细胞8个，血小板少见。患儿2，男性，7岁，以“面色苍白5月余”为主诉就诊。贫血面容，全身皮肤黏膜苍白，未见明显肢体畸形、色素沉着。血常规示：白细胞2.79×109L－1，中性粒细胞0.63×109L－1，血红蛋白68g／L，血小板35×109L－1。生化检查大致正常，Coombs实验阴性，抗血小板抗体阴性。骨髓形态学检查：有核细胞增生极度减低，且粒红细胞比值减低，非造血细胞易见，全片巨核细胞2个，血小板罕见，就诊时拟诊“再生障碍性贫血”，但经治疗后血象未见明显好转。同时收集2个患儿父母的外周血，另取无血液系统疾病儿童的外周血作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 MMC诱导的染色体断裂实验 采集肝素抗凝的外周血2mL。5mL外周血培养基（1640培养基＋15%小牛血清＋PHA＋青／链霉素）中分别加入0.5mL外周血和 MMC（终浓度为0，25，50，100ng／mL），培养66～72h后加入秋水仙胺应用液，阻断3～5h，收获，低渗15min，常规制片，Gimsa染色，镜检。染色体断裂计数：染色体（单体）断裂、染色体（单体）裂隙、染色体的碎片、末端丢失和中间丢失各计为1断裂；双着丝粒、环状染色体、三射体、四射体各计为2个断裂。每组各计数30个分裂相，分析患儿与对照（n＝10）的平均断裂率。

1.2.2 二代测序检测FA相关基因突变 采用Ion AmpliSeqTMDesigner进行引物设计及合成；采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0试剂盒（美国Thermo Fisher公司），按照说明书构建文库。之后进行 模板 制 备，主要采 用 Ion PGMTMHi QTMTemplate Kit试剂盒（美国 Thermo Fisher公司），按照说明书进行操作，使用Ion One TouchTM2Instrument进行乳液PCR，采用Ion One TouchTMES富集模板阳性的ISPs，然后使用Ion PGMTMHi－QTMSequencing Kit试剂盒、Ion 316TMChip Kit v2以及Ion PGMTMSystem，按照说明书进行测序操作。

1.3 统计学处理 使用Ion ReporterTM软件分析突变，利用dbSNP、1000Genome与PolyPhen2数据库进行变异注释以及氨基酸突变分析。

2 结 果

2.1 患儿1的染色体断裂实验和基因突变检测结果 染色体断裂实验结果显示，未加入MMC时，染色体均未发生断裂。MMC浓度为25ng／mL时，染色体畸变率未明显高于对照组；MMC浓度为50与100ng／mL时，染色体畸变率分别为23.33%和44.33%，均高于相应浓度对照组的畸变率（14.67%和26.67%）。二代测序结果显示，检测到FANC C的基因突变，突变位点为C.973G＞A／p.A325，该突变为杂合型，其母亲基因结果为阴性，而其父亲检测到了对应位点的基因突变，表明杂合突变基因遗传自父亲。

2.2 患儿2的染色体断裂实验和基因突变检测结果 染色体断裂实验结果显示，MMC浓度为25，50和100ng／mL时，染色体畸变率分别为13.33%，56.67%和76.67%，均明显高于相应浓度对照组的畸变率（5.33%，14.67%和26.67%），且较易见到有三射体或四射体的分裂相（图1）。二代测序结果显示，其父亲有FANC A基因突变，突变位点有c.A796G＞p.T266A、c.A3982G＞p.T1328A，其突变属于杂合型；其母亲的基因结果为阴性。另患儿2还检出2个位点的突变：c.G2426A＞p.G809D、c.G1235T＞p.A412V（表1）。

图1 MMC诱导的染色体断裂示意图（ ×1 000）Fig 1 Chromosome breakage after MMC treatment（ ×1 000）

表1 患儿2FA相关基因突变检测结果Tab 1 Results of FA genetic mutation detection

3 讨 论

FA是一种常染色体或X连锁隐性遗传病，常有各种先天畸形，如指趾畸形、泌尿生殖系统发育不全、桡骨缺如等。随着年龄的增长，FA患者逐渐表现出体格、智力发育滞后和血细胞一系或多系减少［6－7］。国内对FA疾病的认识不足，根据典型的肢体畸形及全血细胞减少等临床特征只可作出初步的诊断，FA的遗传学诊断尤其是基因水平的诊断在国内开展还较少，因此，国内FA的诊断率远远低于国外。FA患者尤其是无明显的先天畸形、智力发育障碍、骨髓衰竭和继发肿瘤的患者，诊断较为困难，易漏诊和误诊。

FA的诊断除根据临床表现外，还需有FA致病基因检测阳性或染色体断裂实验阳性［8］。染色体断裂实验是最经典的FA确诊方法，但是染色体断裂实验有可能出现假阳性，特别是3月内接受化疗或放疗者；且FA的嵌合体患者对DNA交联剂不敏感，常出现假阴性结果。有报道指出，部分FA患者血中存在2个细胞亚群［1，9－11］，一个对 DNA 交联剂如MMC敏感，另一个对交联剂不敏感，此现象称之为嵌合现象。嵌合现象在FA患者的发生率为20%～30%，染色体断裂实验对体细胞嵌合FA患者常不适用，且染色体断裂实验特异性不足，因为有些罕见基因改变也会导致染色体不稳定，从而引起阳性结果。本研究中，患儿2的染色体断裂实验结果显示，在低浓度MMC诱导下即表现为染色体断裂实验阳性；而患儿1在MMC浓度＞50ng／mL时染色体畸变率才明显高于对照组，而在MMC浓度＜50ng／mL时，染色体畸变率并无明显变化，提示该患者可能为FA的嵌合体。但要确诊为FA还需提供更有力的证据，基因检测就显得尤为重要。目前，对于该病的认识已从染色体水平发展到基因学诊断水平。由于FA涉及17种基因，这些基因散布于整个基因组，大多数FA患者存在FA基因突变，且每个基因存在多种突变形式，如基因大片段缺失和插入、终止突变、错义和框移突变等［12］。FA基因突变类型与其相应的FA亚型临床表现的严重程度密切相关。比如FA的G亚型比C与A亚型更易进展为骨髓增生异常综合征或急性髓细胞白血病［13］。也有研究表明，基因亚型的分析对临床治疗方案的选择很重要，如A亚型患者倾向于晚期发生骨髓衰竭，C和G亚型则有更严重的临床过程，可能需要较早进行骨髓移植。本实验采用二代测序的方法对2个患儿及其父母进行基因突变的检测，患儿1检测到FANC C的基因突变，位点为C.973G＞A／p.A325，且其父亲也检测到同一位点的基因突变，表明突变是由其父亲遗传的，这不仅为其诊断提供了有力的证据，也可以确定其基因型，有利于临床治疗方案的选择，让医生能够在患者的医疗中准确利用基因型或表型之间的关系。患儿2也检测到FANC A的基因突变，除了有其父亲的2个位点突变（c.A796G＞p.T266A，c.A3982G＞p.T1328A）外，还检出了另外2个位点的突变：c.G1235T＞p.A412V，c.G2426A＞p.G809D。不仅证实了杂合突变基因为其父所携带的突变基因，也对其治疗及预后的判断有重要的临床价值。研究表明，影响FA预后的最主要因素是基因型［14］。Faivre等报道，FANC A双等位基因无效突变所导致的FANC A蛋白缺失的患者有早发贫血倾向且更易进展为急性髓细胞白血病，且诊断后的生存期更短［15］。

FA病因为累及单个FA基因的纯合突变或复合杂合突变。大多数FA基因都需要2个等位基因均丧失正常功能才会引起疾病。因此，有效开展FA基因检测鉴定FA患者不同的基因突变至关重要，二代测序可以应用于任意基因突变的检测［16］。本研究利用二代测序技术对FA患者进行常见FA相关基因突变的检测，为2个患儿的临床诊断和确定亚型提供了有力的证据。本研究采用的二代测序可为临床提供更加全面的基因信息，而且可以大大提高检测速度，减少FA基因测序的时间，缩短诊断周期［17－18］，提高临床诊断的可靠性，还可进一步明确FA基因突变与FA临床表型的关系。因此，对怀疑FA的患者建议进行FA基因测序以识别基因缺陷，有助于确诊FA，尤其是嵌合的患者，还有利于鉴别诊断FA与其他非FA的染色体断裂性疾病。