黄芩素联合顺铂对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

蒋国君,刘亚明,王道鑫,赵婉晨,童旭辉

(安徽省生化药物工程技术研究中心,蚌埠 233030;*通讯作者,E-mail:bbmctxh@126.com)

乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤的首位,并以每年2%的速度递增[1]。目前乳腺癌的治疗措施以手术为主,配合化学、内分泌及免疫治疗[2]。顺铂是治疗实体肿瘤的经典药物,但近年来在临床上的应用受限,主要原因是患者长期使用顺铂后,肿瘤细胞对其产生耐药性[3]。黄芩素属于天然的黄酮类化合物,有研究表明,黄芩素可以抗肿瘤,如抑制肝癌细胞、前列腺癌细胞等增殖[4]。本课题组前期研究也表明,在正常睾丸支持细胞中,低剂量的黄芩素可以增加顺铂的毒性[5]。那么,黄芩素是否也可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性呢?因此,本研究采用对乳腺癌MCF-7细胞无毒的黄芩素浓度联合顺铂诱导MCF-7的增殖及凋亡,观察对顺铂抗乳腺癌作用的影响,并且初步探讨其机制,以期为顺铂在临床的扩大应用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

细胞系MCF-7(购于中国科学院细胞库)。MEM培养基(Gibco公司,美国),胎牛血清(四季青公司),顺铂(Cisplatin)、胰蛋白酶(Typsin)、MTT、二甲基亚砜(DMSO)均购于Sigma公司(美国),BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司),兔抗人Bcl-2抗体,兔抗人Bax抗体,鼠抗人β-actin(abcam公司，英国)。

1.2 细胞培养

人乳腺癌细胞MCF-7采用MEM高糖培养基,含有10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/L链霉素,37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。细胞常规培养于培养瓶中,0.25%胰蛋白酶溶液消化传代,1周传代2-3次,传代比例约为1 ∶3。

1.3 MTT法检测细胞存活率

将细胞按5×105/ml的细胞密度接种于96孔板,每孔200 μl,每组药物浓度设5个复孔,另设阴性对照组(不加顺铂或黄芩素)和空白对照组(不加细胞,只加培养基)。黄芩素浓度为0,10,20,40,80,160 μmol/L,顺铂浓度为0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0 μmol/L。加药后24 h终止培养,终止培养前4 h,每孔加MTT(5 g/L)20 μl,弃上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)200 μl/孔,细胞培养箱内孵育30 min,微量振荡器震摇10 min,全自动定量绘图酶标仪测定每孔的495 nm波长处吸光度A值。计算细胞存活率及顺铂作用于细胞24 h的IC50值。

1.4 溴化丙啶法检测细胞早期凋亡

取对数生长期细胞以1.0×105/ml的密度接种于12孔板,第2天给药,药物分组如下:空白对照组、顺铂单用组、顺铂+黄芩素组。继续培养12 h,收集细胞,加入1 ml冰乙醇固定,置于4 ℃冰箱内过夜。流式细胞仪检测前采用溴化丙啶染色液对细胞染色,检测细胞凋亡率。

1.5 Hoechst33258染色法检测细胞晚期凋亡

将细胞以1.0×105/ml的密度接种于6孔板,第2天给药。药物分组如下:空白对照组、顺铂单用组、黄芩素单用组、顺铂联合黄芩素组。继续培养48 h,弃原培养基,PBS洗1次。10%甲醛固定,弃固定液。PBS洗3次,每次5 min。每孔加入10 μg/ml的Hoechst33258染色液1 ml,避光染色20 min。PBS洗3次,每次5 min,弃PBS,倒置荧光显微镜下观察。

1.6 Western blot检测细胞Bcl-2和Bax的表达水平

将细胞以2.0×105/ml的密度接种于6孔板,第2天给药。药物分组如下:空白对照组、顺铂单用组、黄芩素单用组、顺铂联合黄芩素组。继续培养48 h。细胞裂解液冰上裂解30 min,提取细胞总蛋白,采用BCA蛋白定量试剂盒(参照说明书)测各组蛋白浓度,并且将各组蛋白调至浓度一致,与2×上样缓冲液1 ∶1混合,100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。取蛋白50 μg/组,8% SDS-PAGE(60 V,30 min,120 V,120 min)分离蛋白;转膜(50 V,150 min);5%封闭液室温封闭2 h,摇床上孵育;一抗4 ℃孵育过夜;TPBS洗涤3次×20 min;二抗室温孵育2 h;TPBS洗涤3次×15 min;ECL发光试剂盒暗室发光、显影、定影。Bio-Rad凝胶成像系统采集图像。

1.7 统计学分析

实验数据采用SPSS13.0软件进行分析,实验数据采取均数±标准差表示,组间比较使用t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义,图标绘制采用Sigma Plot 10.0。

2 结果

2.1 顺铂和黄芩素对乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制作用

本实验分别采用不同浓度的顺铂和黄芩素作用于MCF-7细胞24 h,观察细胞的存活率。实验结果显示,0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0 μmol/L顺铂刺激MCF-7细胞后,细胞存活率逐渐降低,且呈剂量依赖性(P<0.01)。经计算IC50为14 μmol/L。因此,本研究将采用7 μmol/L进行细胞凋亡检测。

0,10,20,40,80,160 μmol/L黄芩素作用于MCF-7细胞24 h,细胞存活率逐渐降低(P<0.01),且20 μmol/L的黄芩素作用于细胞后,细胞存活率仍为99%(见图1),可认为对细胞无毒性,因此,实验将选择20 μmol/L黄芩素联合顺铂进行后续实验。

与0 μmol/L比较，*P<0.05，**P<0.01图1 顺铂和黄芩素对MCF-7细胞存活率的影响Figure 1 The survival rate of MCF-7 after treated with different concentrations of cisplatin and baicalein

2.2 黄芩素增强顺铂对MCF-7细胞的抗肿瘤作用

将药物分为4组,分别为空白对照组、黄芩素组、顺铂组、黄芩素+顺铂组。黄芩素浓度为20 μmol/L,顺铂浓度为10 μmol/L。本实验首先采用MTT法检测药物对MCF-7细胞24 h存活率的影响。结果显示,10 μmol/L顺铂作用于MCF-7细胞24 h细胞存活率为(58.42±0.04)%,黄芩素联合顺铂作用于MCF-7细胞,细胞24 h存活率仅为(41.56±0.03)%,与单用顺铂组相比,差异有统计学意义(P<0.01,见图2)。

与空白组比较,**P<0.01;与顺铂组比较,##P<0.01图2 黄芩素联合顺铂组的细胞存活率Figure 2 Cell viability of MCF-7 cells after treated with baicalin combined with cisplatin

2.3 黄芩素增强顺铂诱导MCF-7细胞凋亡的作用

为了明确在MCF-7细胞中黄芩素增强顺铂的抗肿瘤作用是否与增加细胞凋亡相关,实验首先采用流式细胞术检测12 h细胞凋亡率,结果显示,黄芩素(20 μmol/L)联合顺铂(7 μmol/L)组的细胞凋亡率显著高于单用顺铂组[16.80±1.20)%vs(10.66±1.63)%,P<0.01,见图3A]。

采用Hoechst33258染色法观察药物对细胞晚期凋亡(48 h)的影响。由图3B可见,对照组和黄芩素组细胞胞核均匀淡染,胞膜完整,胞核形态呈椭圆型,而单用顺铂组和黄芩素联合顺铂组细胞膜通透性增加,细胞核浓集、边缘化,黄芩素联合顺铂组细胞数明显减少,甚至有细胞核碎裂。这表明,黄芩素增强顺铂细胞毒性的作用与其增强顺铂诱导MCF-7细胞的凋亡相关。

2.4 黄芩素联合顺铂对MCF-7细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

实验结果表明,黄芩素联合顺铂后促凋亡蛋白Bax的表达显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低(P<0.01,见图4)。这说明,黄芩素可以通过影响凋亡相关蛋白的表达从而增强顺铂的抗肿瘤活性。

3 讨论

顺铂是临床常用的抗肿瘤药物,属于细胞周期非特异性药物,是多种肿瘤化疗方案中的组成药物,对肺癌、睾丸癌、卵巢癌等实体瘤都有很好的疗效。但是长期单独用药后产生耐药是目前限制顺铂在临床使用的重要原因[6,7]。近年来,天然药物与化疗药物联用抗肿瘤的应用成为研究热点。黄芩素是从中药黄芩中提取的重要单体,属于黄酮类化合物,是黄芩的主要有效成分之一。许多研究表明,黄芩素可以抑制多种肿瘤细胞(如人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等)的增殖,影响细胞周期分布,诱导细胞凋亡[8,9]。本实验也证明,黄芩素单独应用有一定的抗乳腺癌作用,且随着浓度的增加,抗肿瘤作用增强。

图3 黄芩素对顺铂诱导细胞凋亡的影响Figure 3 The influence of baicalein on apoptosis of MCF-7 cells induced by cisplatin

与空白组比较,**P<0.01;与顺铂组比较,##P<0.01图4 黄芩素联合顺铂对MCF-7细胞中Bax和Bcl-2表达的影响Figure 4 The expression level of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells after treated with baicalein and cisplatin

本课题组前期研究表明,在正常睾丸支持细胞TM4中,低浓度的黄芩素(对细胞无毒)可以增强顺铂的细胞毒性[5]。在耐顺铂的肺癌细胞株A549/CDDP中,对细胞生长无影响的黄芩素浓度与不同浓度的顺铂联用均可明显增强顺铂对A549/CDDP的抗肿瘤作用[10]。本实验首先采用MTT法初步验证了0-160 μmol/L浓度的黄芩素作用于乳腺癌细胞MCF-7,在20 μmol/L黄芩素作用于细胞24 h后,细胞的存活率仍能够达到99%。因此,后续联合用药的研究选择了20 μmol/L的黄芩素浓度。

肿瘤细胞凋亡能力下降是非常重要的导致细胞过度增殖的原因[11]。在本实验中,黄芩素可以增加顺铂的抗肿瘤作用,但是否是通过增加细胞凋亡来完成的呢?本研究采用碘化丙啶染色法及Hoechest33258染色法检测了细胞的凋亡情况,研究表明,无论是早期凋亡还是晚期凋亡,黄芩素均可以增加顺铂诱导的MCF-7细胞的凋亡率,且结果有一定的显著性。

Bcl-2是一种重要的凋亡调控基因,在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要的调控作用。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成员,可促进细胞凋亡,Bax因与Bcl-2蛋白共同免疫沉淀而被鉴定[12,13]。Bcl-2与Bax蛋白的比率决定异二聚体(Bcl-2/Bax)与同二聚体(Bax/Bax)的比值,这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用[14]。本实验结果显示,Bcl-2与Bax蛋白在乳腺癌MCF-7凋亡中表达水平发生了改变,在黄芩素联合顺铂时,MCF-7细胞中Bcl-2的表达显著降低,而Bax的表达上调,这表明,黄芩素通过增加Bax、降低Bcl-2的表达水平从而增强了顺铂的抗肿瘤作用。

综上,本研究证实黄芩素在不影响细胞增殖的情况下可以明显增加顺铂抗肿瘤的作用,其机制是通过上调Bax的表达和下调Bcl-2的表达,使Bcl-2/Bax比值减小,从而达到促进细胞的凋亡。本研究为顺铂的临床应用提供了实验基础,也为扩大化疗药物的应用提供了一个良好的策略。