自噬对视网膜色素上皮细胞表达bFGF及TGF-β2的调控作用

田 瑾,李 蓉,杜军辉,姚 杨

(1渭南市中心医院眼科,渭南 714000;2西安医学院第一附属医院眼科;3西安交通大学附属西安市第九医院眼科;4西安医学院第一附属医院中心实验室;*通讯作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

RPE细胞层处于富含血管的脉络膜和视网膜神经上皮层之间,具有多种复杂的生理生化功能,如屏障功能、吞噬功能、参与视循环代谢、抗氧化功能和分泌生长因子等[1]。RPE细胞通过分泌多种生长因子影响神经视网膜细胞及其自身的生理特性,这些生长因子有的参与RPE细胞自身的功能调节,有的则与眼部疾病的发生密切相关。其中,bFGF和TGF-β2是研究较为广泛的生长因子,已证实它们与近视的发生发展有着密切联系[2-5]。

自噬是一种细胞内降解机制,其过程是细胞通过溶酶体降解自身胞质成分来满足细胞自身的代谢需要以及某些细胞器的更新,从而维持细胞内环境稳态[6,7]。与多数其他细胞一样,RPE保持着基本的自噬水平以维持细胞稳态,并随者年龄和疾病发生变化。在应激环境如缺氧、氧化应激、非折叠蛋白反应或炎症中,RPE细胞的自噬可被激活[8,9]。然而,目前关于病理状态下RPE细胞自噬激活与其表达bFGF和TGF-β2水平的关系尚不清楚。基于此,本研究以人RPE为对象,观察缺氧条件下其自噬变化对细胞分泌bFGF和TGF-β2的影响,为进一步研究RPE自噬在眼部疾病中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

人RPE细胞(ARPE-19细胞系)(武汉普诺赛生命科技有限公司),DMEM/F12培养基(美国Gibco公司),3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美国Selleck公司),氯喹(CQ)(美国Sigma公司),兔多抗LC3B(美国Cell signaling公司),兔多抗Beclin-1(美国Cell signaling公司),兔多抗p62(美国Cell signaling公司),兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司),HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司),人bFGF ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司),人TGF-β2 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。倒置相差显微镜(日本Olympus,IX51型),三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司,HF-100型),全自动酶标仪(美国Thermo scientific,Multiskan MK3型)。

1.2 细胞传代培养

用不含EDTA的0.25%胰酶消化ARPE-19细胞,用DMEM/F12培养基(含10%FBS+1%青霉素和链霉素)终止消化,传代至到培养皿中,轻轻吹打混匀,在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。本研究使用5-10代ARPE-19细胞。

1.3 细胞处理及分组

将处于对数生长期的ARPE-19细胞按照5.0×105个/孔传代于6孔板内,待细胞贴壁后,按如下分组分别处理细胞:对照组(常氧),缺氧组(置于1% O2,5%CO2,94% N2三气培养箱),缺氧+3-MA组(缺氧处理的同时加入10 mmol/L 3-MA),缺氧+CQ组(缺氧处理的同时加入50 umol/L CQ),四组细胞在37 ℃ 5%CO2饱和湿度条件下培养24 h。

1.4 Western blot检测RPE细胞自噬蛋白LC3B、Beclin-1及p62的表达

细胞处理完成之后,弃培养液,PBS漂洗2次,加400 μl RIPA裂解液裂解细胞,使细胞充分裂解,离心提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。按每孔40 μg总蛋白加样,采用30%聚丙烯酰胺凝胶电泳、120 V条件下分离蛋白,200 mA、50或90 min条件下转膜。采用含5%脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜,室温摇床封闭2 h。封闭液稀释相应的一抗[稀释]比例分别是：LC3B(1 ∶1 000)、Beclin-1(1 ∶1 000)、p62(1 ∶1 000)，GADPH(1 ∶1 000)]，4 ℃摇床孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜，用封闭液稀释相应的HRP标记的二抗(1 ∶50 000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h。TBST充分洗涤PVDF膜，ECL显色，BandScan软件分析胶片灰度值，将结果与内参GAPDH的表达比较，计算相对值。每组3次生物学重复。

1.5 ELISA检测RPE细胞bFGF及TGF-β2的表达

实验开始前，各试剂平衡至室温；充分混匀试剂或样品，避免起泡。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。给酶标板覆膜，36 ℃孵育90 min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔中加入生物素化抗体工作液100 μl(在使用前20 min内配制)，给酶标板加上覆膜，36 ℃温育1 h。弃去液体，洗板5次，每次浸泡30 s，大约350 μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。空白孔加酶结合稀释液,其余孔加酶结合物工作液(临用前20 min内配制，避光放置)100 μl，加上覆膜，36 ℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加显色剂(TMB)100 μl，酶标板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加终止液100 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。以bFGF和TGF-β2标准品浓度为纵坐标，OD值为横坐标，做直线相关回归，据待测样本的OD值在标准曲线上查出该样本的bFGF和TGF-β2水平对应值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 ARPE-19细胞形态

应用倒置荧光显微镜观察细胞超微结构并摄片,在同一培养瓶中,ARPE-19细胞形态随细胞密度不同表现出不同形态:低密度时以梭形为主,少量细胞为多边形,高密度时以多边形为主,少量细胞表现为梭形,胞浆内无明显黑色素颗粒(见图1)。不同处理组之间的细胞形态无明显差异,但缺氧+3-MA组和缺氧+CQ组比正常组和缺氧组的凋亡细胞数量增多。

A.低密度 B.高密度图1 光镜下观察培养24 h的ARPE-19细胞形态 (×100)Figure 1 Representative images of cell morphology of ARPE-19 under optic microscope (×100)

2.2 缺氧对RPE细胞自噬水平的影响

Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,缺氧组细胞的自噬被激活,表现为LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值、Beclin-1这两种自噬标志蛋白表达条带的明显增强和p62蛋白的减弱。当采用3-MA或CQ预处理细胞后,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达明显降低或升高,Beclin-1的表达则明显降低,而p62的表达明显升高(见图2)。正常对照组、缺氧组、缺氧+3-MA组和缺氧+CQ组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值分别为0.24±0.02,0.50±0.05,0.34±0.01和0.67±0.05;Beclin-1相对表达量分别为0.32±0.040,0.97±0.05,0.78±0.06和0.54±0.01;p62相对表达量分别为1.03±0.02,0.32±0.10,0.78±0.08和0.96±0.02。各组总体比较差异均有统计学意义(F=19.78,P<0.001;F=139.29,P<0.001;F=70.64,P<0.001)。其中缺氧组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值和Beclin-1的蛋白相对表达量均明显高于正常对照组,p62蛋白相对表达量明显低于对照组;缺氧+3-MA组中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值、Beclin-1的蛋白相对表达量均明显低于缺氧组,缺氧+CQ组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显高于缺氧组,Beclin-1的蛋白相对表达量明显低于缺氧组;缺氧+3-MA组和缺氧+CQ组的p62蛋白表达量均明显高于缺氧组,以上差异均有统计学意义(P<0.05,见图3)。

2.3 缺氧对RPE细胞表达bFGF的影响

获得bFGF的标准曲线(见图4A)和浓度方程[y=(-0.313 7+1 489.188 0x)/(1-0.374 1x+0.051 9x2)],得到不同分组细胞上清液中bFGF含量。对照组、缺氧组、缺氧+3-MA组、缺氧+CQ组细胞的bFGF的浓度(pg/ml)分别是:1 771.01±110.38,3 709.79±262.68,3 026.24±230.39,2 610.01±183.52。单因素方差分析表明,四组间bFGF浓度的差异具有统计学意义(F=46.97,P<0.001,见图4B)。

2.4 缺氧对RPE细胞表达TGF-β2的影响

获得TGF-β2标准曲线(见图5A)和浓度方程[y=(-0.259 6+355.554 4x)/(1-0.111 1x-0.037 3x2)],得到不同分组细胞上清液中TGF-β2含量。对照组、缺氧组、缺氧+3-MA组、缺氧+CQ组细胞的TGF-β2的浓度(pg/ml)分别是:256.11±27.63,516.85±57.94,439.45±17.53,353.58±33.12。单因素方差分析表明,四组之间TGF-β2浓度的差异具有统计学意义(F=27.35,P<0.001,见图5B)。

图2 Western blot检测各组细胞LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Beclin-1和p62的蛋白表达Figure 2 Expression of LC3B-Ⅰ, LC3B-Ⅱ, Beclin-1 and p62 in different groups by Western blot

与对照组比较,*P<0.01;与缺氧组比较,#P<0.01图3 不同处理后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin-1和p62相对蛋白表达Figure 3 The relative protein expression of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ, Beclin-1 and p62 after different treatment

与对照组比较,*P<0.001;与缺氧组比较,#P<0.01,##P<0.001图4 bFGF浓度标准曲线及其各组比较的统计分析Figure 4 The standard curve of bFGF concentration and the statistical analysis of bFGF concentration by ELISA

3 讨论

在疾病状态下,视网膜细胞的结构和功能会发生改变,产生一系列的病理生理变化,其中RPE细胞是病变的中心环节之一。RPE是一种具有重要功能且与多种眼科疾病密切相关的色素细胞,其结构或者功能异常可引起视网膜病变、视觉功能异常,严重者可致盲。但是,对RPE细胞的生物学功能及其调控机制尚不完全清楚。本研究表明,在缺氧刺激下,RPE细胞自噬被激活,同时细胞分泌bFGF及TGF-β2的水平升高,且通过抑制细胞自噬能够降低bFGF及TGF-β2的表达。此研究结果提示,通过调控RPE细胞自噬能够调控bFGF及TGF-β2的表达,可能进一步参与眼部疾病的形成过程。

与对照组比较,*P<0.001;与缺氧组比较,#P<0.05图5 TGF-β2浓度标准曲线和各组比较的统计分析Figure 5 The standard curve of TGF-β2 concentration and comparison of TGF-β2 concentration among four groups by ELISA

bFGF也称FGF2,由155-163个氨基酸组成。TGF-β家族至少由6个结构相关的分子组成,人、鼠等哺乳动物的TGF-β己克隆出β1、β2、β3这3种亚单位。多种动物实验及体外实验证实,bFGF与TGF-β2这两种生长因子可影响近视的发生[3-5]。在对近视发病机制的研究中,“视网膜局部调控学说”认为,视网膜感知外界环境变化后产生一级近视信号因子(如视黄酸、多巴胺、血管活性肠肽、胰岛素样生长因子等)并作用于RPE,使之产生二级信号因子(bFGF、TGF-β2等),从而启动了视网膜-RPE-脉络膜信号转导系统,把局部视网膜信号转化为调控巩膜细胞外基质重塑的信号,使眼轴增长而导致近视的形成[10]。不过,在RPE细胞内通过何种信号转导途径调控bFGF和TGF-β2的分泌尚未完全阐明,其分泌还受哪些因素的影响也有待进一步研究[11,12]。本研究提示,细胞自噬调控bFGF及TGF-β2的分泌可能在近视的发生中也具有一定的促进作用。

据报道,bFGF与TGF-β2也是重要的促血管生成因子,参与眼部新生血管性疾病,例如CNV等的发生[13,14]。大量研究表明,大量细胞生长因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)、bFGF及TGF-β2等都均参与了CNV的发生过程[15,16]。Frank等[17]用人的CNV标本和小鼠CNV模型进行研究,发现RPE细胞分泌的bFGF在CNV中具有致病作用,且与VEGF在促进血管形成方面可能起协同作用。另有研究表明,将浸有bFGF的明胶水凝胶植入视网膜下,能诱导实验性CNV的形成[18]。许多学者证实,TGF-β与新生血管形成密切相关[19]。在体内条件下,TGF-β可以诱导单核细胞、T细胞、中性粒细胞和纤维母细胞聚集,后者释放大量促新生血管形成因子,间接地起到促进血管生成的作用。Nagineni等[20]在培养人RPE细胞的体外实验中发现TGF-β诱导RPE细胞和脉络膜细胞表达VEGF在CNV中扮演重要角色,证实TGF-β参与CNV的形成。Ogata等[21]对激光诱导的大鼠CNV模型的研究表明RPE细胞、脉络膜毛细血管内皮细胞和成纤维样细胞的TGF-β mRNA表达升高。本研究以ARPE-19细胞(广泛用于研究CNV等疾病的一种细胞模型)为研究对象,发现在缺氧条件下,RPE细胞分泌bFGF和TGF-β2明显增加,与上述研究结果相符。

细胞自噬能对内环境稳定进行自我维持,且在生长、发育、细胞自我保护等多种生理活动中发挥着重要的作用。LC3,Beclin-1和p62等作为自噬标记蛋白被广泛用于自噬的相关研究中。当自噬体形成时,胞浆型LC3(LC3-Ⅰ)酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(LC3-IL)[22]。LC3B作为LC3的一种亚型,普遍被用作自噬的分子标志。Beclin-1是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必须成分[23]。p62是另一常用的自噬溶酶体膜相关自噬标记蛋白,当自噬被诱导后,自噬体与溶酶体结合并纳入、降解p62,其表达降低,故p62的水平与自噬呈负相关[24]。鉴于不同自噬抑制剂的作用机制存在差异,在本研究中我们采用了早期抑制剂3-MA和晚期抑制剂CQ。3-MA作用于自噬诱导阶段,可特异性阻断自噬体的形成[8,9];CQ是一种溶酶体自噬抑制剂,可以破坏溶酶体的酸碱环境,阻止自噬体与溶酶体的结合,从而抑制自噬的最后一个过程[25]。本研究证实,在缺氧环境下,RPE细胞的自噬被激活,表现为LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ,Beclin-1蛋白表达增加,而p62被溶酶体降解,其表达下降。3-MA作用后抑制了自噬体的形成,导致LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ下降,p62水平增加;CQ作用后阻止了自噬体与溶酶体的结合,从而不能降解LC3和p62,导致LC3蓄积,故LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ增加,p62升高。3MA和CQ处理后得到的结果一致,证明抑制自噬可导致RPE细胞分泌bFGF和TGF-β2减少。前期研究证实,缺氧条件下细胞自噬激活可促进视网膜血管生成[26,27],结合本研究结果,推测自噬激活促进RPE细胞分泌bFGF及TGF-β2可能在视网膜和脉络膜新生血管的形成中也发挥一定作用。

综上,本研究提示缺氧条件下RPE细胞自噬被激活,自噬可以通过调控RPE细胞bFGF及TGF-β2的分泌进一步参与眼部疾病的发生,如近视和视网膜/脉络膜新生血管。不过,自噬对RPE细胞分泌bFGF和TGF-β2的调控机制,以及对近视和视网膜/脉络膜新生血管形成等眼部疾病的确切影响还需深入探究。