p16INK4a蛋白在胸腹水细胞蜡块中的表达及临床意义

郭 睿，李 曼，赵世平，黄小钟，金雪媛，杨 军

(西安交通大学第二附属医院病理科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:yangjundr@163.com)

准确的病理诊断是肿瘤治疗、疗效分析、预后检测的前提和基础,也是延长带瘤生存时间、降低肿瘤死亡率、改善预后的根本。因此,寻找广谱性好、敏感性和准确率高的肿瘤标志物显得十分重要。胸腹水是进展期恶性肿瘤最为常见一种临床表现,是肿瘤发生胸腔脏器或胸膜腔转移导致的继发改变。但是,由于进展期恶性肿瘤患者同时也会合并其他良性病变引起胸膜腔积液,比如,结核、肺心病、胸膜炎、肝硬化、低蛋白血症、终末期肾病、恶病质等。因此,准确、快速地从胸腹水样本中查找肿瘤细胞,确定胸腹水性质对于判断恶性肿瘤的进展、评价疗效、预测预后、指导制定治疗方案具有不可替代的重要价值和意义。为此，许多学者尝试选择多种分子靶标和制片技术以期提高诊断的准确率[1-3]。

p16基因又叫多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1,MTS),是一种调控细胞周期的抑癌基因,其编码的p16INK4a蛋白定位于细胞核内,是细胞周期依赖性激酶抑制因子(inhibitors of cyclin-dependent kinase 4,Ink4)和重要的抑癌基因,在细胞周期调控和肿瘤发生中发挥重要调控作用。既往认为,当p16基因由于缺失、突变、甲基化造成p16INK4a蛋白异常表达时,导致细胞的无限增殖引发肿瘤[4-6]。本研究采用免疫组化方法检测胸腹水细胞蜡块中p16INK4a蛋白表达情况,分析其作为胸腹水恶性肿瘤相关分子靶标的敏感性(sensitivity,SEN)、特异性(specificity,SPE)、阳性预测值(positive predictive value,PPV)、阴性预测值(negative predictive value,NPV),并探讨p16INK4a蛋白表达在良恶性胸腹水的早期诊断、鉴别诊断中的意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择2014-03～2015-03西安交通大学第二附属医院存档的胸腹水细胞蜡块标本77例,男性42例,女性35例,年龄范围21-87岁,平均54岁。所有病例均经病理学及临床确诊。恶性肿瘤胸腹水样本60例,其中包括肺癌30例,乳腺癌7例,原发性肝癌5例,卵巢癌2例,其他恶性肿瘤16例;良性病变胸腹水样本17例,其中包括细菌性肺炎7例,结核性胸(腹)膜炎3例,冠心病2例,肝硬化5例。

1.2 试剂和仪器

Anti-p16INK4a(clone 6H12)鼠单克隆抗体购自中国福州迈新生物技术开发有限公司。DAB染色试剂盒,使用全自动免疫组化仪器Ventana Bench Mark XT(瑞士,罗氏)。

1.3 HE染色和免疫组化染色方法

所有标本均经离心沉渣包埋、4 μm厚切片、常规HE染色及免疫组化染色。免疫组化染色采用Ventana Bench Mark XT全自动免疫组化染色仪完成。用已知阳性标本作对照,用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断

p16INK4a免疫组化染色按照质/核型分子判读标准进行判读[7]:①0,无着色;②+,≤10%细胞呈现不同程度的细胞质着色;③++,10%-30%的细胞胞质呈现强的棕褐色着色,或≤70%细胞胞质呈现弱或中等强度质着色;④+++,>30%细胞胞质呈强的棕褐色着色,或>70%的胞质呈中等强度着色。评分为“0”者判读为阴性(表达缺失),评分为“+”者判读为弱阳性(正常表达),评分为“++”和“+++”者判读为阳性(表达上调)。

1.5 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件处理全部数据,各组间阳性率差异采用χ2检验。计算p16INK4a诊断恶性胸腹积液的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。

2 结果

2.1 p16INK4a蛋白在胸腹水细胞蜡块样本中表达

免疫组化染色结果显示p16INK4a蛋白的表达模式为质/核型,在不同类型的胸腹水细胞蜡块样本中表达强度不尽相同:p16INK4a蛋白在良性胸腹水细胞蜡块样本中呈阴性或弱阳性表达,在恶性胸腹水样本中呈阴性和不同强度的阳性表达(见图1)。

p16INK4a蛋白在77例良、恶性胸腹水细胞蜡块样本中呈阴性(0)、弱阳性(+)、阳性(++)和强阳性(+++)表达的样本比例各不相同,按照组成比进行统计学分析发现p16INK4a蛋白表达良性、恶性胸腹水样本之间存在统计学差异(χ2=11.142,P=0.025),而在肺癌样本与其他样本之间无统计学差异(χ2=1.717,P=0.424,见表1)。

按照p16INK4a表达强度,将阴性(0)和弱阳性(+)病例合并为阴性组(≤+),将阳性(++)和强阳性(+++)病例合并为阳性组(≥++)后,在60例恶性胸腹水细胞蜡块样本中,p16INK4a蛋白表达上调(≥++)高达83.33%,其中在肺癌样本中86.66%,其他恶性肿瘤样本中80.00%,而在良性病变组仅为26.66%。经统计分析发现p16INK4a蛋白在恶性和良性病变胸腹水细胞蜡块样本中的阳性表达存在显著差异(χ2=9.737,P=0.008)。但在肺癌和其他恶性肿瘤中的表达并无统计学差异(χ2=0.483,P=0.731,见表2)。

2.2 p16INK4a的敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值

按照p16INK4a表达强度将阴性(-)和弱阳性(+)病例合并为阴性组(≤+)、将阳性(++)和强阳性(+++)病例合并为阳性组(≥++)后,以活检结果作为标准,p16INK4a蛋白作为肺癌性胸腹水样本诊断指标的敏感性为76.47%，特异性为69.23%，阳性预测值为86.67%，阴性预测值为52.94%,作为其他恶性肿瘤胸腹水诊断指标的敏感性为75.00%，特异性为60.00%，阳性预测值为80.00%，阴性预测值为52.94%;将肺癌组与其他恶性肿瘤组样本合并后,p16INK4a蛋白作为恶性胸腹水样本诊断指标的总敏感性为75.76%、特异性为64.29%、阳性预测值为83.33%、阴性预测值为52.94%(见表3)。

A.肺腺癌胸水HE染色(×20);B.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈阳性表达(×40);C.肺腺癌胸水p16INK4a蛋白呈强阳性表达(×40);D.卵巢癌腹水HE染色(×40);E.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈弱阳性表达(×40);F.卵巢癌腹水p16INK4a蛋白呈强阳性表达(×40)图1 p16INK4a蛋白在胸腹水细胞蜡块样本中的表达Figure 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

表1 p16INK4a蛋白在胸腹水细胞蜡块样本的表达 例(%)Table 1 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion 例(%)

a恶性肿瘤组与良性病变组比较;b肺癌组与其他恶性肿瘤组比较

表2 p16INK4a蛋白在胸腹水细胞蜡块样本中表达 例(%)Table 2 Expression of p16INK4a protein in paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion cases(%)

a恶性肿瘤组与良性病变组比较;b肺癌组与其他恶性肿瘤组比较

表3 p16INK4a蛋白表达在诊断良、恶性胸腹水细胞蜡块样本诊断中的价值Table 3 The diagnostic value of p16INK4a protein expression for benign and malignancy of paraffin-embedded specimens from ascites and pleural effusion

3 讨论

p16INK4a基因是首个被发现的直接参与细胞周期调控的抑癌基因。在正常细胞周期中,p16INK4a蛋白对CDK4/6-cyclinD1/Rb-E2F环路起负向调控作用,通过与周期蛋白D竞争结合CDK4/6,引起Rb蛋白脱磷酸化而失活,阻断细胞周期通过R点而停留在G1期,从而维持细胞周期、调控平衡,并在肿瘤细胞的细胞周期调控和增殖中发挥重要的抑制作用[8-11]。

作为一种抑癌基因,既往研究认为在肿瘤组织中p16INK4a基因突变、缺失、启动子甲基化导致的p16INK4a的表达缺失或下调是其重要分子机制[12-15]。但近来研究发现,在相当多肿瘤中p16INK4a蛋白的表达呈显著性上调状态[16-19],更有学者研究报道,p16INK4a甲基化和表达可同时存在[20,21]。因此,对于p16INK4a蛋白表达水平的判读并不能简单解读为阴性表达或阳性表达,p16INK4a蛋白的阴性表达和强阳性表达均是肿瘤细胞特征性的免疫表型,反映的是两种不同的细胞周期调控机制:p16INK4a蛋白呈现全阴性表达,预示p16基因缺失或启动子区的高甲基化是肿瘤细胞周期调控异常的重要机制;当p16INK4a蛋白呈现弥漫强阳性核/质型表达时,说明Rb基因突变、缺失、甲基化引起的Rb蛋白缺失、低表达或活性降低,或cyclinD1-CDK4/6过度活化引起的Rb高磷酸化是肿瘤细胞周期调控异常的重要机制。

现已证实高危型HPV阳性的宫颈癌和癌前病变中均发现p16INK4a基因过表达与肿瘤的性质和HPV感染密切相关,而且采用免疫组化检测p16INK4a的表达已成为HPV相关宫颈高级别病变及宫颈癌等恶性肿瘤分子的诊断的特异性分子靶标而被CFDA批准用于临床[22-24]。本课题组近年来研究发现[25,26],除了HPV相关肿瘤,p16INK4a在多种非HPV相关恶性肿瘤中可出现代偿性高表达,而这种代偿性高表达阳性率高达70%以上,其中在乳腺癌的研究中,已将p16INK4a代偿性高表达作为特异性标志,并应用于乳腺癌的诊断和鉴别诊断[26]。

本实验通过将77例胸腹水制作成细胞蜡块,采用免疫组织化学检测p16INK4a蛋白的表达,结果发现,p16INK4a蛋白在恶性肿瘤和良性病变胸腹水样本中的阳性表达存在显著差异(P<0.05),但在肺癌和其他恶性肿瘤的表达并无显著差异。这说明p16INK4a代偿性高表达是胸腔转移性肿瘤细胞周期异常的重要模式,但与恶性肿瘤的来源和组织学类型无明显相关性。

进一步分析发现,将胸腹水细胞蜡块免疫组化染色结果与最终活检结果相比,肺癌组敏感性为76.47%、特异性69.23%、阳性预测值86.67%、阴性预测值52.94%;其他恶性肿瘤组敏感性为75.00%、特异性60.00%、阳性预测值80.00%、阴性预测值52.94%;将两组合并后其敏感性最终活检结果相比为75.76%、特异性64.29%、阳性预测值83.33%、阴性预测值52.94%。由此可见,p16INK4a蛋白可作为广谱肿瘤标志物,并适用于良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断。

寻找肿瘤特异性标志物一直是提高恶性肿瘤诊断准确率的重要途径[27,28],尤其是对于胸腹水等体液样本,由于受到背景细胞的影响,单纯从细胞病理学水平,以形态学判读并不能满足临床诊断的需要。而p16INK4a蛋白以其特有的代偿性高表达模型和广谱特征,为良恶性胸腹水样本的诊断和鉴别诊断提供了简单、实用的肿瘤特异性分子靶标,且具有较好的敏感性和阳性预测值,适用于良、恶性胸腹水等体液样本的诊断和鉴别诊断。

综上所述,p16INK4a蛋白的表达缺失和代偿性高表达均是恶性胸腹水中肿瘤细胞的免疫表型特征,可以作为良恶性胸腹水等体液样本诊断和鉴别诊断的分子靶标,且广谱性好、敏感性和阳性预测值高,适合用于良恶性胸腹水的诊断和鉴别诊断,有助于提高恶性胸腹水的阳性检出率。