我国首例非洲猪瘟的确诊

王清华，任炜杰，包静月，戈胜强，李金明，李 林，樊晓旭，刘春菊，王 华，张永强，徐天刚，段亚良，顾贵波，周晨阳，吴晓东

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，国家外来动物疫病研究中心，山东青岛 266032；2. 辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100%。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV不感染人，对人的健康不构成威胁。目前，针对ASF防控，尚无有效的商品化疫苗。

2018年8月1日，国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现ASF临床可疑病例的报告（图1）。截至8月1日，发病猪场累计死亡47头，对刚病死的2头猪剖检发现：脾脏极度肿大，严重梗死，质脆易碎，其中一头猪脾肿大至少10倍，另一头猪肿大5～7倍；肺出血、质硬，有间质性肺炎变化；下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血，切面呈大理石样变；胃浆膜面弥漫性出血；肾肿胀明显、色淡，未见出血点；扁桃体见陈旧性出血，符合ASF症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测，证实本次疫情由ASFV引起。这是我国历史上的首次ASF发病记录。

图1 发病场地理位置

1 材料与方法

1.1 病料

病原样品：来源于2头病死猪的剖检病料，包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体；30头临床健康猪的全血。

血清样品：2头病死猪及同群30头临床健康猪血清。

1.2 病料DNA提取

在加有陶珠的组织匀浆管（Roche）中，加入600 µL PBS缓冲液，再加入剪碎的组织样品约30 mg，使用HyBaid RiboLyser组织匀浆机进行匀浆处理。取200 µL组织匀浆液和全血，分别使用病毒DNA提取试剂盒提取DNA。最后将提取的核酸于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 荧光定量PCR

依据文献[1]报道，用本实验室建立的，OIE推荐的ASFV特异荧光定量PCR方法，进行ASFV p72基因片段扩增。ASFV特异性引物为king-s/king-a，TaqMan探针为ASFVP，同时以本实验室合成的质粒DNA标准品为阳性对照。

1.4 普通PCR

依据文献[2]报道，用本实验室建立的，OIE推荐的ASFV特异PCR方法，进行ASFV p72基因片段扩增。ASFV特异性引物为PPA1/PPA2，产物长度为257 bp，同时以本实验室合成的质粒DNA标准品为阳性对照。

1.5 测序片段PCR扩增

依据文献[3-4]报道，合成扩增p72基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix扩增B646L/p72基因片段。预期扩增片段大小为478 bp。50 μL 的PCR反应体系为：2×Phusion Master Mix 25 µL，p72-D（10 μmol/L）和 p72-U（10 μmol/L）各 2 µL，模板DNA 2 μL，用灭菌水补齐体积至50 μL。PCR反应程序为：98 ℃预变性30 s；然后进行35个PCR 循环（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72 ℃ 10 min。

1.6 PCR产物测定

将扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收，对回收的DNA 直接用于测序。序列拼接采用Lasergene 7.1软件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA）中的EditSeq与MegAlign模块。多序列比对和遗传进化树绘制应用MEGA 5.0软件进行。其他国家的参考毒株序列从GenBank中获得。

1.7 抗体检测

西班牙INGENASA公司生产的非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号为050218，包被抗原为p72蛋白；法国ID-vet公司生产的非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒，批号为B71，包被抗原为p30、p62、p72重组蛋白；国家外来动物疫病研究中心自主研发的非洲猪瘟间接ELISA试剂盒，批号为201801，包被抗原为p30蛋白。

2 结果

2.1 荧光定量PCR

荧光定量PCR检测结果显示，采自2头病死猪的8份组织样品和全血中都能检测到ASFV特异性扩增曲线，Ct值为19.14～26.5（图2）。

2.2 普通PCR

ASFV普通PCR扩增结果显示，7个样本（全血1、淋巴结1、肾1、脾1、全血2、淋巴结2、肾2）在257 bp左右有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图3）。样本脾2特异性扩增条带较弱。

图2 实时定量PCR扩增结果

图3 普通PCR检测结果

2.3 p72基因片段序列遗传进化分析

对样本B646L/p72基因片段普通PCR产物进行正反向测序，对得到的序列进行拼接后获得p72基因片断序列，长度为417 bp（图4）。对扩增的P72基因序列，应用邻接法（Neighbor-joining）绘制遗传进化树（图5）。结果显示，该样本病毒属于基因II型，与目前在俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株（Georgia 2007）同属于一个进化分支。

图4 样本p72基因片段测序结果

图5 P72基因遗传进化分析

2.4 抗体检测

32份血清样品的ASFV特异性抗体检测均为阴性。

3 讨论

ASFV是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属的唯一成员，基因组为双股线状DNA，大小为170～190 kb。根据病毒编码主要衣壳蛋白p72的B646L基因，可将该病毒分为24个与地域性相关的基因型[5-6]。基因II型流行于非洲东南部，2007年传至格鲁吉亚，并扩散到俄罗斯联邦和东欧地区[7]，已在高加索地区定殖；2017年，该基因型病毒向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克[9]，导致传入我国的风险空前升高。目前，ASF已经成为困扰欧洲养猪业的一个重要问题[8]。该病的跨国界传播和危害性使其成为全球性问题。

本次疫情是我国确诊的首起非洲猪瘟疫情。该猪场生物安全条件较差，紧临车辆繁忙的乡间公路，场区出入口无消毒池。病死猪在当地兽医部门监督下已就近作掩埋处理，有相应的生猪保险理赔记录。剩余存栏生猪336头，临床未见异常。据了解，死亡猪多为100 kg的大猪。p72基因片段遗传进化分析显示，本次流行的毒株为基因II型，与在俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支，提示疫情可能来自俄罗斯和东欧疫情国家。为进一步确定病毒与俄罗斯和东欧流行株的差异，正在对其全基因组序列进行分析。值得注意的是，该起疫情的病死率虽然很高（100%），但发病率和死亡率较低，发病高峰期10头左右，平常日均死亡3头左右。此外，同群猪临床健康，随机采集的30头猪的抗凝血、血清样品的病原学检测结果和血清学检测结果均为阴性，提示该起疫情的毒株群内传播能力或有一定局限性。

感染生猪及其产品的移动是导致疫情快速远距离传播的主要途径。尤其值得注意的是，ASFV在未经高温处理的肉品中存活能力很强，未经高温处理的泔水、烟熏肉、风干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨区域传播的重要因素。历史上，多起跨境传播的ASF疫情均与航空器、火车运载的上述猪肉制品的处理不当以及感染ASF野猪的移动有关[10]。目前，应加强流行病学调查和主动监测排查，特别是对病死猪的检测，应重点关注屠宰场、病死生猪无害化处理场等高风险场点，对已发现的确诊病例要做进一步追溯排查；加大科普宣传，发动养猪户、诊疗人员和相关从业人员主动上报可疑情况。若发生疫情，应严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》和《非洲猪瘟防治技术规范》进行处置。