副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定及初步应用

杨 杰，李建达，丛晓燕，杨胜男，任素芳，郭立辉，陈 智，陈 蕾，曾 昊，孙文博，时建立，李 俊，邱文彬，3，吴家强，3，于 江

（1. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；2. 青岛市动物疫病预防控制中心，山东青岛 266000；3. 山东师范大学生命科学学院，山东济南 250014）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）是定居于健康猪上呼吸道的常在菌，在特定条件下可以侵入机体，引起多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等疾病[1]。近年来，随着我国养猪业规模化和集约化发展，副猪嗜血杆菌病常以继发方式存在于规模化猪场，且暴发规模呈逐渐上升趋势，导致断奶到保育阶段仔猪的发病率及死亡率增加，对养猪业造成较大经济损失，影响了养猪业的健康发展，已成为我国猪场中重要的细菌性传染病[2]。

HPS血清型复杂，可分为15个血清型，另外还有20%左右的分离菌株不能进行血清学分型[3]。蔡旭旺等[4]研究表明，我国以血清4型和5型最为流行，其次是13型、14型和12型。本课题组前期研究发现，血清1型在我国也较为流行[5]。近几年，越来越多研究者致力于HPS毒力因子和致病机制研究。目前报道的HPS毒力因子主要包括脂多糖（LPS）、转铁蛋白、菌毛、荚膜（CP）、外膜蛋白（Outer membrane proteins）等[6-12]，但对LPS的研究较少。Wang等[13]通过用HPS血清5型菌株接种动物，发现血液中LPS抗体的出现与血栓形成以及弥漫性血管内凝血密切相关，说明HPS中的LPS 具有与其他革兰氏阴性细菌内毒素相似的活性。本研究通过提取、鉴定，获得高纯度的LPS，并将其应用于猪肺泡巨噬细胞，为进一步阐明LPS的致病机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 HPS血清5型LZ株：由本实验室分离、鉴定、保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 Tris平衡酚：购自北京索莱宝科技有限公司；DL2000 DNA Marker：购自大连宝生物公司；RNase A：购自Sigma公司；聚乙二醇4000：购自上海玉博生物科技有限公司；透析袋、DNase I：购自Solarbio公司；BCA蛋白定量试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白酶K：购自上海玉博生物科技有限公司；凝胶成像系统：购自Bio-Rad公司；真空冷冻干燥机Alpha 1-2 LD plus：购自天津钧星瑞科技有限公司；超速冷冻离心机：购自贝克曼库尔特有限公司；酶标仪：购自美国伯腾仪器有限公司；NanoDrop 2000微量紫外可见分光光度计：购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备 TSA培养基：称取40 g TSA粉末（美国BD公司），加入到940 mL蒸馏水中，灭菌后冷却至50 ℃左右，再加入50 mL新生牛血清（济南劲牛公司）和10 mL过滤除菌的0.1%的NAD（Sigma公司）溶液，充分摇匀后倒平皿。TSB培养基：称取30 g TSB粉末（美国BD公司）加入到940 mL蒸馏水中，高压灭菌；临用前加入50 mL新生牛血清（济南劲牛公司）和10 mL过滤除菌的0.1%的NAD（Sigma公司）溶液，混合均匀。

1.2.2 菌体制备及收集 将冻存的HPS血清5型LZ株菌种复苏后，挑取单菌落接种于10 mL TSB培养基，37 ℃摇床培养16 h；按1%的比例接入种子液，于37 ℃ 180 r/min摇床培养至OD600nm=1.3；菌液经5 000 r/min离心5 min，收集菌体；用磷酸缓冲液（PBS）洗涤2次，5 000 r/min离心15 min，将沉淀称湿重，用3倍体积无菌去离子水悬浮。

1.2.3 LPS提取与纯化 参考热酚水法[14]提取LPS，并作适当改进。将菌悬液反复冻融3次后，加入等体积的68 ℃ 90%的苯酚溶液，68 ℃水浴，边加边振荡；水浴1 h后，冰上冷却至10 ℃，8 000 r/min离心30 min，收集上层水相；将下层酚相补充等体积去离子水，按上述方法重复抽提1次；合并两次水相，加入等量的90%苯酚溶液重复抽提1次；合并所有水相，装于透析袋中，流水透析1 d，蒸馏水4 ℃透析2 d（每天换水5次），到FeCl3检测无紫色出现为止；按每100 mL溶液加入聚乙二醇6000固体4 g的比例，将溶液浓缩为原来的1/4；浓缩后加入终浓度为50 μg/mL的DNase I和50 μg/mL的RNase A，37 ℃酶解过夜，再加入终浓度为100 μg/mL的蛋白酶K，65 ℃作用1 h；将处理后的样品置于100 ℃沸水中加热10 min，冷却至室温后，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min；收集上清，加入2倍体积丙酮，4 ℃静置过夜，4 ℃ 3 500 r/min离心15 min，沉淀称重；用无菌超纯水配成浓度为15～20 mg/mL溶液后超离，4 ℃30 000 r/min离心2 h，下层胶体即为LPS；冷冻干燥即得纯化的 LPS 提取物，-20 ℃保存备用。

1.2.4 脂多糖定性试验 取LPS溶液100 μL，加入现配置的斐林试剂（0.1 g/mL NaOH与0.05 g/mL CuSO4按1:1混合）100 μL，同时做葡萄糖阳性对照和单蒸水阴性对照，沸水浴反应2 min，观察溶液颜色变化。

1.2.5 LPS成分测定

1.2.5.1 多糖含量测定 采用硫酸-苯酚法测定LPS糖含量。配置0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL装入试管，用无菌去离子水补至1.0 mL，每管加入1 mL 6%苯酚溶液并摇匀，再迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀，静置10 min，置65 ℃水浴中18 min，取出后迅速冰浴冷却至室温，用酶标仪检测490 nm处吸光值，绘制标准曲线。另取100 μL样品加入900 μL去离子水，按上述方法，检测OD490nm值，利用标准曲线方程计算样品多糖含量。

1.2.5.2 蛋白含量测定 采用BCA法测定蛋白含量，按说明书绘制标准曲线。取100 μL提取物加入900 μL去离子水，按说明书方法重复检测3次，取平均值，根据标准曲线方程计算提取物中的蛋白含量。

1.2.5.3 核酸含量测定 用NanoDrop 2000微量紫外可见分光光度计测定提取物中核酸含量。

1.2.5.4 琼脂凝胶电泳 1.5%的琼脂凝胶电泳分析。2 μL LPS 加入 1 μL 6×Loading Buffer，80 V 恒压电泳20 min后，用GelDox XR+凝胶成像系统观察。

1.2.5.5 SDS-PAGE电泳及银染 参考文献[13，15]方法，对提取物进行SDS-PAGE电泳，结束后银染，拍照分析结果。

1.2.6 LPS在猪肺泡巨噬细胞中的应用 将106CFU/mL的原代肺泡巨噬细胞接入24孔板，37 ℃5% CO2培养过夜，然后分别加入107CFU的HPS和10 μg的LPS提取物，同时设TLR4抑制剂（100 ng/mL TAK-242处理1 h）和空细胞对照；培养12 h后，弃营养液，用灭菌PBS冲洗2次后，用1 mL Trizol裂解细胞，提取细胞总mRNA；用荧光定量PCR检测IL-1β表达量，试验重复3次。IL-1β引物序列见表1。

表1 IL-1β引物序列

2 结果与分析

2.1 LPS提取与纯化

HPS在1 000 mL TSB培养基中培养1 d后，收集的菌体湿重为2.50 g，纯化的LPS为64 mg，平均LPS产率为2.56%。

2.2 多糖定性试验

提取物与斐林试剂反应无颜色变化，而以葡萄糖作阳性对照的溶液变为砖红色，表明提取物中不含还原性单糖（图1）。

图1 多糖与斐林试剂反应的还原性分析

2.3 LPS多糖含量

以0.1 mg/mL葡萄糖为标准品制作标准曲线，其方程为y=0.528 1x+0.059 4，R2=0.996 6。将所测样品的OD490nm平均值代入方程，得出多糖浓度为209.4 μg/mL，纯化的LPS多糖含量为3.27%（图2）。

图2 葡萄糖标准曲线

2.4 LPS蛋白含量

以BCA溶液制作标准曲线，其方程为：y=1.042 4x+0.172 7，R2=0.991 4。从标准曲线中得出提取物中蛋白浓度为0.49 mg/mL，通过计算得出纯化的LPS中蛋白含量为0.77%（图3）。

2.5 LPS核酸含量

用NanoDrop 2000测得核酸总量为575.1 μg/mL，通过计算得出核酸含量为0.90%。

2.6 琼脂糖凝胶电泳

纯化后的提取物中含有少量核酸杂质，核酸片段大小低于100 bp（图4）。

2.7 SDS-PAGE电泳及银染

SDS-PAGE电泳和银染鉴定结果显示，提取、纯化的LPS呈典型的多糖特异性梯状条带（图5）。

2.8 LPS在猪肺泡巨噬细胞中的应用

分别用HPS和LPS提取物作用于猪肺泡巨噬细胞，发现两者分别作用后，猪肺泡巨噬细胞IL-1β的表达量均显著上调（P＜0.05），且HPS全菌感染细胞的IL-1β上调更显著。TLR4抑制剂TAK-242作用组较未作用组，IL-1β表达量显著降低（P＜0.05），说明HPS及其LPS均能引起宿主细胞IL-1β表达量的上调，但抑制TLR4受体会降低LPS诱导的IL-1β的表达（图6）。

3 讨论与结论

图3 BCA标准曲线

图4 LPS提取物琼脂糖凝胶电泳

图5 银染鉴定结果

图6 猪肺泡巨噬细胞IL-1β相对表达量

HPS是猪上呼吸道的一种常在菌，可影响2周龄到4月龄的猪只，主要在断奶后的保育阶段引起发病，发病率一般为10%～15%，严重时死亡率可达50%，是影响全球养猪业健康发展的重要细菌之一[16]。近几年，副猪嗜血杆菌病常与猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病以混合或继发形式出现，导致发病猪死亡率逐渐增高。因此，关于HPS毒力因子及致病机制的研究越来越广泛。本试验主要致力于HPS毒力因子LPS的提取及纯化鉴定，并应用于猪肺泡巨噬细胞，检测IL-1β表达量变化情况，为HPS对宿主细胞的致病性研究提供理论依据。

脂多糖LPS为革兰阴性菌细胞壁的主要成分，在结构上可分为O-侧链多糖、核心多糖及脂类A，是主要致病因素之一。大剂量LPS可引起内皮细胞的损伤和屏障功能的改变，导致发生呼吸道疾病以及发热、低血压、脓毒性休克，甚至死亡。而微量LPS能活化单核巨噬细胞系统，促进细胞因子释放以及补体的活化和抗体的产生，对特异性免疫反应具有调节作用，如抗肿瘤、增强机体特异性抵抗力等[17-18]。目前，国内外报道的提取脂多糖方法主要有3种：三氯乙酸法、酚水法和酚-氯仿-石油醚法。不同的提取纯化方法对LPS的产率、纯度和生物活性有很大影响。酚水法提取的LPS浓度和免疫活性强于其他两种方法，且因LPS产量高、操作简单而被广泛用于LPS提取。尽管目前已有商品化的细菌LPS提取试剂盒，且已有研究使用过该方法[19-20]，但试剂盒仅适合少量LPS提取。任慧君等[21]通过热酚水法提取HPS的LPS，将粗提的LPS经过葡聚糖凝胶层析柱，获得纯化的LPS。该方法对仪器要求较高。本试验采用酚水法，通过聚乙二醇6000浓缩粗提LPS，再经过DNase I、RNase A和蛋白酶K处理，去除DNA、RNA和蛋白质，最终用丙酮沉淀，超离获得纯化的LPS，平均LPS产率为2.56%。该结果虽然低于冯将等[22]猪源大肠杆菌的产率（3.74%），但高于杨成兰等[14]丙型副伤寒沙门氏菌的产率（1.48%）和刘红亮等[23]肠出血性大肠杆菌的产率（1.025%）。该方法虽然较上述方法复杂，但对仪器没有特殊要求，操作方便易行。

本试验提取的LPS虽然含有少量蛋白，但在LPS提取纯化过程中经过苯酚和蛋白酶K处理，会使蛋白变性、结构破坏，从而失去了蛋白原有的功能。酶解法纯化后的LPS提取物中虽然含有少量核酸，但用商品化的大肠杆菌LPS作比对，也能检测出。

综上，本试验提取的HPS LPS纯度较高，蛋白和核酸含量较少，能够引起宿主细胞细胞因子变化，可用于HPS LPS致病机制的进一步研究。