小麦中呕吐毒素不同检测方法的对比研究

吴艺影 应玲红 盛林霞 陈舒萍

【摘要】为了研究小麦中呕吐毒素不同检测方法的差异性与相关性，寻找小麦入库作业时快速检测法可靠性范围，对45份小麦样品进行胶体金试纸条、ELISA、HPLC的检测。结果显示：试纸条法（1000μg/kg）结果呈阴性为合格样品，呈阳性需HPLC复检；ELISA结果小于1000μg/kg时为合格样品，结果为1000～1300μg/kg时需HPLC复检，结果大于1300μg/kg为不合格样品。

【关键词】胶体金试纸条；ELISA；HPLC；小麦；呕吐毒素

呕吐毒素（vomitoxin），又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），由禾谷镰刀菌产生，属单端孢霉烯族化合物。近年来随着气候变化，呕吐毒素污染粮食呈上升趋势，尤其是小麦被污染后产量降低、品质下降，毒素难以去除。人和动物食用被污染的小麦及其制品后会对健康造成威脅，因此高效、准确地检测出呕吐毒素含量具有重要意义。

作为储备粮库，主要使用了胶体金试纸条法、酶联免疫吸附法（ELISA）和高效液相色谱法（HPLC）等方法检测呕吐毒素。胶体金试纸条法简便快速，可用肉眼进行定性分析，检测成本低。酶联免疫吸附法（ELISA）对样品纯度要求不高，特异性强。以上两种方法均属于快速检测法，不能准确定量，易受到温度等条件的影响，存在较大的误差。高效液相色谱法（HPLC）定量准确，对操作人员要求高且样品处理比较复杂，仪器昂贵、检测成本高、花费时间长、耗费溶剂较多，不适合大批量样品的快速检测。

根据GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》要求，小麦中呕吐毒素限量为≤1000μg/kg，粮食入库作业时间紧、数量大，三种方法各有优势，如何区分使用是重点。本实验通过对快速检测法和HPLC法检测小麦中呕吐毒素的结果进行比较，探索不同方法之间的差异性与相关性寻找快速检测法可靠性范围，合理使用快速检测法和HPLC法，降低实验成本，提高工作效率。

1材料与方法

1.1材料与试剂

试验样品：2017年产浙江小麦20份、2015年产山东小麦25份样品。对照样品：呕吐毒素含量为（1137±20%）μg/kg。

呕吐毒素免疫亲和柱，呕吐毒素ELISA检测试剂盒，呕吐毒素快速检测试纸条（500～2000μg/kg）；脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，纯度≥98%；甲醇、乙腈，均为色谱级；聚乙二醇（相对分子质量8000）；玻璃纤维滤纸，直径llcm，孔径1.5μm。

1.2仪器与设备

e2695高效液相色谱仪（配2489紫外检测器）：美国Waters公司；HF4500酶标仪：北京华安麦科生物技术有限公司；HSE-24B固相萃取装置：天津市恒奥科技发展有限公司；MTN-2800W氮吹浓缩装置：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；JFSD-100粉碎机：上海嘉定粮油仪器有限公司；HY-2调速多用振荡器：常州国华电器有限公司。

1.3实验方法

共进行了5次实验：每次实验检测9份试验样品、1份对照样品，进行1次加标回收实验。

1.3.1胶体金试纸条法

采用1000μg/kg的检测限。称取5.0g均质样本于具塞三角瓶中，加入20mL蒸馏水，充分震荡5min，静置过滤。移取50μL滤液加入样品稀释液2000μL，混匀后待检。取出已恢复至室温的微孔试剂和试纸条，用移液器取200μL待检液于微孔试剂中，混匀，室温孵育4min。将试纸条浸入微孔溶液中，室温反应5min，读取结果。

1.3.2 ELISA法

称取5.0g粉碎后的小麦样品，加入25ml蒸馏水，200r/min振荡10min，静置3min后用定量滤纸过滤，取1ml滤液以蒸馏水1：4稀释，手动摇匀后取50μL进行分析。取出已恢复至室温的微孔板和液体试剂，按照说明书的要求操作点样。

检测参数：设定酶标仪于450nm/630nm处检测，读取浓度。

1.3.3 HPLC法

采用GB 5009.111-2016《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法。

为避免样品不均匀性导致的误差，ELISA法和HPLC法采用同一份滤液。将滤液经玻璃纤维滤纸过滤，移取2.5ml滤液过免疫亲和柱，收集洗脱液，在50～60℃条件下氮吹近干，加入1mL流动相复溶，复溶液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶，准备进样。

色谱柱：C18柱（柱长150mm）；流动相：甲醇+水（20+80）；流速；0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL；检测波长：218nm。

1.3.4加标回收实验

为验证前处理损失大小、检测结果的准确性，进行了加标回收实验，标准品添加量为1000μg/kg。

2实验结果

2.1对照样品检测和加标回收实验合国标中回收率要求，实验结果可靠。HPLC法和ELISA法最大偏差远低于国标（HPLC法重现性≤23%，ELISA法重现性≤25%），两种检测方法均重现性良好。

2.2 ELISA-HPLC结果相关性

由图1可知，两种方法检测结果的一致性较高，线性相关系数R=0.984 5。ELISA试剂盒法具有较高的准确性，可以保证检测结果的可靠性。

2.3临界值样品检测结果

以HPLC检测结果为划分依据，对含量在临界点附近的样品汇总。其中，试纸条法检测结果阴性以“一”表示，阳性以“+”表示。

由表2～表4可知，样品DON含量<800μg/kg时，试纸条检测结果呈阴性时，EHSA结果<1000μg/kg；样品DON含量为800～900μg/kg时，试纸条结果呈阳性，ELISA结果在1000μg/kg上下浮动，存在误差。样品DON含量为900～1100μg/kg时，试纸条结果均呈阳性，ELISA在1000μg/kg上下浮动。样品DON含量为1100～1300μg/kg时，试纸条结果均呈阳性，ELISA结果均>1000μg/kg。

3结论

试纸条法具有快速检测、单个样品检测成本低等优点，样品数量少时可优先采用此方法，以1000μg/kg为检出限，若检测结果呈阴性，结果可靠，判定合格。当样品数量大，可采用ELISA法，若检测结果<1000μg/kg，判定合格；若ELISA检测结果为1000～1300μg/kg，或试纸条法呈阳性，应采用HPLC检测法进一步检测DON含量。当ELISA检测结果>1300μg/kg时，可判定样品DON含量超标。