HPLC法测定绿芫菁中斑蝥素的含量

王腾蛟 赵成坚 谷颖乐 徐永莉 李力

中图分类号 R284.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）07-0930-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.16

摘 要 目的：建立綠芫菁中斑蝥素的含量测定方法，并将测定结果用于筛选提取斑蝥素来源药材的依据。方法：以丙酮为溶剂，采用超声提取法提取绿芫菁中斑蝥素；采用高效液相色谱法测定斑蝥素的含量；色谱柱为C18，流动相为甲醇-水（23 ∶ 77），检测波长为230 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为10 μL；检测绿芫菁中斑蝥素的含量并与采用《中国药典》方法（以氯仿为提取溶剂）测定含量的结果进行比较。结果：斑蝥素检测质量浓度线性范围为0.2～1.0 mg/mL（r=0.998 8），平均方法回收率为101.1%（RSD为1.7%，n=6）；绿芫菁中斑蝥素的平均含量为0.932%（n=3），采用《中国药典》方法测得的含量为0.793%（n=3），均高于《中国药典》项下斑蝥素来源药材中斑蝥素含量需大于0.35%的要求。结论：建立的绿芫菁中斑蝥素的含量测定方法准确可靠；绿芫菁中斑蝥素的含量达到《中国药典》的要求，可用作提取斑蝥素的来源药材。

关键词 绿芫菁；斑蝥素；高效液相色谱法；丙酮提取；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of cantharidin in Lytta caraganae， and to use the result as the extract screening evidence of L. caraganae source material. METHODS： Ultrasonic extraction method was used to extract cantharidin from L. caraganae using acetone as solvent. HPLC method was adopted to determine the content of cantharidin. The determination was performed on C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （23 ∶ 77） at flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set 230 nm， the column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 10 μL. The content of cantharidin in L. caraganae was determined and compared with the results of content determination by the method stated in Chinese Pharmacopeia （using chloroform as extraction solvent）. RESULTS： The liner range of cantharidin were 0.2-1.0 mg/mL （r=0.998 8） with average methodology recovery rates of 101.1% （RSD=1.7%， n=6）. The average content of cantharidin in L. caraganae was 0.932% （n=3）， while the content of cantharidin was 0.793% （n=3） determined by the method stated in Chinese Pharmacopeia. Both were higher than the requirement of Chinese Pharmacopeia that the content of cantharidin in scource material of cantharidin was higher than 0.35%. CONCLUSIONS： Established method is accurate and reliable for the content determination cantharidin in L. caraganae. The content of cantharidin is up to the standard of Chinese Pharmacopeia， and can be used as source material for exacting cantharidin.

KEYWORDS Lytta caraganae； Cantharidin；HPLC； Acetone extraction； Content determination

芫菁为鞘翅目（Coleoptera）芫菁科（Meloidae）昆虫的通称，是多食亚目的一个重要类群，又名斑蝥或地胆、葛上亭长。斑蝥入药始载于《神农本草经》，其具有破血逐瘀、散结消癥、攻毒蚀疮的功效[1]，用于治疗癥瘕、经闭、顽癣、瘰疬、赘疣、痈疽不溃、恶疮死肌等症。现代临床医学将斑蝥中主要成分斑蝥素（Cantharidin，CTD，C10H12O4）用于治疗神经性皮炎、颜面神经麻痹、斑秃、顽癣、过敏性鼻炎等症[2]，该成分还主要具有抗肿瘤活性。2015年版《中国药典》（一部）所载药用斑蝥有2种，即南方大斑蝥（大斑芫菁，Mylabris phalerata Pallas）和黄黑小斑蝥（眼斑芫菁，Mylabris cichorii Linnaeus）[3]。据相关文献报道，南方大斑蝥中斑蝥素含量一般为 1.0%～1.2%，黄黑小斑蝥中斑蝥素含量为1.0% 左右，但亦有达1.3%者。另一种含斑蝥素的芫菁科昆虫贵州短翅豆芫菁中斑蝥素含量为2.7%[4-6]。《中国药典》规定药材中斑蝥素含量不得少于0.35%[3]。随着对斑蝥素研究的不断深入，其来源药材大斑芫菁和眼斑芫菁的数量急剧下降，故开发新的含有斑蝥素的昆虫资源已经迫在眉睫。绿芫菁属于鞘翅目芫菁科绿芫菁属（Lytta），又名青娘子，主要分布于北京、浙江、河北等省市以及东北三省、内蒙古和新疆等自治区。绿芫菁成虫和幼虫中均含有斑蝥素，且这种野生昆虫数量巨大，并已经实现人工饲养[7-8]。已有利用贵州短翅豆芫菁等提取斑蝥素并测定其含量的报道[5]，但目前尚未见对绿芫菁中斑蝥素含量进行研究的报道。因此，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法测定绿芫菁中斑蝥素的含量，通过其含量的高低确定是否可将绿芫菁作为提取斑蝥素的来源药材。

1 材料

1.1 仪器

2695 HPLC仪、2489紫外检测器（美国Waters公司）；KQ-700DV台式数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；XS205 DualRange分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；Himac CR22G高速冷冻离心机（日本日立公司）；RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）。

1.2 药材与试剂

绿芫菁购自河北安国中药材市场，由广西药用植物园主任技师谢保令鉴定为正品（2017年9月）；斑蝥素对照品（上海柏卡化学技术有限公司，cas号：56-25-7，批号：MUST17022706，纯度：>98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取斑蝥素对照品100.00 mg，加入乙腈使其溶解，稀释并定容至100 mL量瓶中，摇匀，制备成1 mg/mL的对照品贮备溶液，并储存在冰箱中。使用时，用乙腈稀释成所需質量浓度的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

将绿芫菁成体进行前处理。60 ℃烘干，粉碎，过筛。称取粉末约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中；加入丙酮超声处理（功率：400 W，频率：40 kHz）3次（每次100 mL、50 min），合并丙酮溶液，过滤，用少量丙酮淋洗沉淀[8]。将提取出的斑蝥素混合液进行纯化，先经过无水碳酸钠柱除油，再经过无水硫酸钠柱除水，并用少量丙酮淋洗柱子。将过柱液在具塞锥形瓶中用旋转蒸发仪旋转浓缩致干（转速80 r/min、温度55 ℃），残渣加入2 mL乙腈，摇匀，并用0.45 μm的一次性针筒过滤器过滤后，滤液保存备用。

2.3 绿芫菁中斑蝥素的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为安捷伦公司的C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为甲醇-水（23 ∶ 77，V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为230 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。取“2.2”项下溶液在220～400 nm 波长下扫描，紫外吸收光谱见图1；取“2.1”“2.2”项下溶液进色谱仪分析，理论板数按斑蝥素峰计应不低于3 000。色谱图见图2。

2.3.2 线性关系考察 精密制备0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL系列质量浓度的斑蝥素对照品溶液，进样分析。以色谱峰面积为纵坐标（y）、斑蝥素质量浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，计算得回归方程为y=103.5x-7.9（r=0.998 8）。表明斑蝥素检测质量浓度线性范围为0.2～1.0 mg/mL。

2.3.3 精密度试验 精密吸取0.4 mg/mL斑蝥素对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定峰面积并计算RSD。结果，峰面积的RSD为0.4%（n=5），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 称取同一批干燥绿芫菁粉末，共4份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定并计算RSD。结果，峰面积的RSD为0.8%（n=4），表明本方法重复性好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12 h注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，峰面积的RSD为1.6%（n=5），表明供试品溶液在放置12 h内稳定。

2.3.6 油脂及水的干扰试验 取0.2 mg/mL斑蝥素对照品溶液，精密吸取2.0 mL，分别置于10个离心管中，编号为1～10，均加入10 μL无水丙酮。将前5个离心管中的混合液分别过无水碳酸钠柱和无水硫酸钠柱，后5个离心管不过柱。取各管液进样测定，计算其中斑蝥素的含量。

结果，编号1～5各管样品中斑蝥素的平均含量为204.248 μg/L（RSD=0.7%，n=5），测量值与真实值偏差为2%；编号6～10各管样品中的斑蝥素平均含量为167.900 μg/L（RSD=3.0%，n=5），测量值与真实值偏差为16%，表明油脂及水对试验结果的干扰较大。因此，去除油脂及水后能显著提高试验结果的准确度。

2.3.7 准确度试验 分别精密称定已知含量的绿芫菁粉末1.0 g，共6份，各加入相同量的绿芫菁对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果，斑蝥素的平均回收率为101.1%（RSD=1.7%，n=6），详见表1。

2.3.8 样品含量测定 取样品3份，按照“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，每份供试品连续进样3次，每次进样10 μL，记录峰面积，计算绿芫菁中斑蝥素含量。结果，3份样品药材中斑蝥素含量分别为0.927%、1.000%、0.869%，平均值为0.932%，即每100 g药材中含斑蝥素0.932 g，远高于药典中对斑蝥素来源药材的斑蝥素的含量要求。

2.3.9 《中国药典》含量测定方法结果 在《中国药典》[3]中，供试品溶液制备时采用氯仿超声提取法提取药材中斑蝥素，按照此法提取并测定绿芫菁中斑蝥素含量。结果，3份样品药材中斑蝥素平均含量为0.793%。表明采用本文建立的提取方法，且以丙酮作为提取试剂，能更多地提取出绿芫菁中的斑蝥素，提取率更高。

3 讨论

3.1 提取时间考察

本文的提取方法为超声提取法，超声波可致生物体系发生各种生物效应，其中包括破坏细胞后分离出某些成分。理论上，超声时间越长对药材细胞破坏越有利[9]。为了确定本品提取时的最优超声时间，笔者测定了供试品在加入20 mL丙酮后经不同时间超声（30、40、50 min）后斑蝥素的含量，各试验3次。结果表明，超声30、40、50 min时的峰面积分别为97.605、131.810、140.206，以超声50 min时的峰面积最大，即提取出的斑蝥素含量最高，故最终选择超声时间为50 min。

3.2 样品处理中的脱油、脱水操作

笔者在预试验中，取用绿芫菁、大斑芫菁、眼斑芫菁3种药材，在未进行脱油脂及脱水的情况下，发现绿芫菁经旋干浓缩后油脂残留较多，多次检测后的结果显示，与大斑芫菁和眼斑芫菁的供试品溶液比较，绿芫菁供试品溶液中有效成分的出峰时间不太稳定，峰面积相对较低。故笔者认为与斑芫菁和眼斑芫菁比较，在绿芫菁药材中油脂和水分较多，且对含量测定影响较大。为了确保试验结果的准确性，清除样品自身所含有物质对试验结果的影响，提高斑蝥素提取率，故本次研究时设计了油脂及水的干扰试验。将供试品溶液通过无水硫酸柱和无水碳酸柱的方式进行脱油、脱水，既保证了各峰间分离度良好，又确保了试验结果的准确性。

3.3 样品提取溶剂的选择

在提取绿芫菁的斑蝥素时，本研究使用的提取溶剂为丙酮，与《中国药典》相关操作中使用的氯仿[3]相比，以丙酮为提取溶剂的提取率更高且操作性更强，与已有试验结果报道一致[10-12]。这可能是因为丙酮沸点为56 ℃，而氯仿沸点为61 ℃，温度高时更易破坏有效成分，所以用丙酮提取时有效成分相对破坏量更少，提取量更高[13]。二者的对比试验结果也表明，使用丙酮为提取试剂时，绿芫菁中斑蝥素提取率更高。

从本研究的结果可知，绿芫菁体内斑蝥素的含量达到0.932%，符合《中国药典》中规定的斑蝥素含量不低于0.35%的要求[3]，即笔者认为可将绿芫菁作为提取斑蝥素的药材来源。由于近年来对具有抗癌作用的斑蝥素需求量的不断增大，导致大斑芫菁和眼斑芫菁数量急剧下降，而开发新的含有斑蝥素的昆虫资源，可缓解大斑芫菁和眼斑芫菁野生资源减少的压力，促进生态平衡，同时满足日益增长的斑蝥素的市场需求。

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（收稿日期：2017-11-16 修回日期：2018-01-24）

（编辑：刘 萍）