基于形态和DNA序列分析的海龙类药材商品的基原调查

刘富艳 金艳 袁媛 秦雯 蒋超 赵玉洋 黄璐琦

摘要 目的：为市售海龙药材的鉴别以及建立质量控制标准提供科学依据。方法：对我国主要药材市场的海龙类商品进行收集，并通过形态鉴别和DNA分子鉴别确定海龙商品基原。结果：共有刁海龙Solenognathus hardwickii（Gray，1830）、拟海龙Syngnathoides biaculeatus（Bloch，1785）、舒氏海龙Syngnathus schlegeli Kaup，1856、宝珈枪吻海龙Doryichthys boaja（Bleeker，1850）、黑斑刁海龙Solegnathus lettiensis Bleeker，1860、斗氏刁海龙Solegnathus dunckeri Whitley，1927、多棘刁海龙Solegnathus spinosissimus Günther，1870、粗吻海龙Trachyrhamphus serratus（Temminck et Schlegel，1847）、光粗吻海龙Trachyrhamphus bicoarctatus（Bleeker，1857）、长吻粗吻海龙Trachyrhamphus longirostris Kaup，1856、葛氏海蠋鱼Halicampus grayi Kaup，1856等11种基原，其中黑斑刁海龙、斗氏刁海龙、光粗吻海龙、长吻粗吻海龙为首次在中药市场中发现。结论：本文所进行的DNA序列分析结合形态鉴别方法也对其他中药材的市场调查和商品基原鉴别研究提供了模式。

关键词 海龙药材；市场调查；分子鉴别

Abstract Objective：To provide scientific basis for the identification and establishment of quality control standards of medicinal Syngnathus sold in the markets.Methods：The Syngnathus commodities in herbal markets were collected，and the origin base of Syngnathus commodities was determined through morphological characteristics and DNA molecule identification.Results：There were 11 species of origin including Solenognathus hardwickii（Gray，1830），Syngnathoides biaculeatus （Bloch，1785），Syngnathus schlegeli （Kaup，1856），Doryichthys boaja（Bleeker，1850），Solegnathus lettiensis （Bleeker，1860），Solegnathus dunckeri （Whitley，1927），Solegnathus spinosissimus（Günther，1870），Trachyrhamphus serratus（Temminck et Schlegel，1847），Trachyrhamphus bicoarctatus（Bleeker，1857） and Halicampus grayi （Kaup，1856）.The origin of S.lettiensis，S.dunckeri，T.bicoarctatus and T.longirostris was observed for the first time in commercial herbal markets.Conclusion：The method of DNA sequences analysis combined with morphological characteristics identification also provided a model of other market surveys and commodity origin identification study in Chinese herbal markets.

Key Words Syngnathus； Market survey； Molecular identification

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.001

中药商品基原调查是系统整理中药品种，改善药材市场品种混乱情况，确定真伪鉴别目标，提高中药质量标准的前提条件。海龙是我国传统名贵中药材，有温肾壮阳、散结消腫的作用。2015年版《中华人民共和国药典》收载其基原为海龙科动物刁海龙（Solenognathus hardwickii，Gray）、拟海龙（Syngnathoides biaculeatus，Bloch）或尖海龙（Syngnathus acus Linnaeus）的干燥体[1]。由于目前海龙未能实现有效的人工养殖，海龙野生资源日益减少，市场情况日趋复杂。此前调查研究认为，市场上常见混伪品主要有粗吻海龙（Trachyrhamphus serratus）、海蠋鱼（Halicampus grayi）、宝珈海龙（Doryichthys boaja）、多棘刁海龙（又名贡氏柄颌海龙，Solegnathus spinosissimus）、蓝海龙（又名蓝点副海龙，Hippichthys cyanospilos）、低海龙（又名低副海龙，Hippichthys heptagonus）、冠海龙（Corythoichthys conspicillatus）、舒氏海龙（Syngnathus schlegeli）等，但目前由于外来药材数量增加，且海龙的性状鉴别特征主要包括体长、体色、眼径、头长、背鳍、胸鳍、尾鳍形态等，在干制过程中，部分性状损坏，难以区分，而其体色和表面纹理特征在去除皮膜过程中消失或发生改变，部分混伪品与正品海龙形态差异不明显，需要建立更为稳定准确的基原鉴别方法。近年来随着分子系统学和生物信息学的发展，包含管口鱼目在内的动植物核酸数据库已逐步建立[2-4]。而此前不同的药源研究结果均不一致、对于同一基原的形态描述也有差异[5-7]，造成市场上品种混乱，掺伪掺假现象普遍存在，急需对商品海龙的基原进行进一步的澄清。本文通过形态归类结合细胞色素c氧化酶I基因（COI）序列分析对收集到的126批市售商品海龙进行物种基原调查，为海龙鉴别提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Veriti 96孔梯度PCR扩增仪（Applied Biosystem公司）、VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries公司）、SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）、Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪（Thermo Fisher公司）。

1.2 试剂 蛋白酶K（Promega公司）、Ex Taq DNA聚合酶（Takara公司）、SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶（Takara公司）、2000 bp DNA Marker（Takara公司）、Wizad SV Genomic DNA Purification System试剂盒（Promega公司）。

1.3 分析样品 海龙药材采购于河北安国、安徽亳州、四川成都、广西玉林、广东清平、广东普宁、山东鄄城、云南昆明中药材市场，共收集样品126份，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。见表1。

2 方法与结果

2.1 形态鉴别 所有样品均根据《中华人民共和国药典》《南海鱼类志》[8]、《黄渤海鱼类图志》[9]、《东海鱼类志》[10]、《中国海洋鱼类》[11]、FishBase全球鱼类数据库[12]的要求进行形态鉴别。

2.2 PCR鉴别

2.2.1 DNA提取 样品使用70%乙醇擦拭表面，晾干。取海龙肌肉组织样品约30 mg，置洁净的2 mL离心管中，经DNA提取研磨仪研磨至粉末，按照Wizad SV Genomic DNA Purification System试剂盒说明书提取总DNA，采用Nanodrop 2000微量核酸定量分析仪测定其浓度，并根据A260/A280，A260/A230的值判断DNA提取质量，用于PCR反应或于-20 ℃保存备用。

2.2.2 PCR扩增及电泳检测 取所提取的DNA，使用COI通用引物、鱼类通用引物Fish 1或鱼类通用引物Fish 2进行PCR扩增[13-14]。PCR反应体系为25 μL，包含dd H2O 19 μL，2.5 μL 10× PCR buffer，1.5 μL dNTP（10 mmol/L），上游及下游引物各0.25 μL（10 μmol/L）、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶或SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1 μL Mg2+（10 μmol/L），1 μL DNA模板。扩增结束后取5 μL PCR产物，加入4 μL 6×Loading buffer于EtBr染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像，扩增引物及反应程序见表2。

2.2.3 测序及数据处理 取阳性扩增产物经纯化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.，USA）测序仪以对应引物进行双向测序，测序由睿博兴科生物技术有限公司完成。使用BioEdit 7.2.6软件对测序峰图进行校对、去除引物序列及拼接，获得对应测序结果。序列使用DNAsp 5.0软件进行单倍型分析，每种单倍型均经NCBI数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和BOLD Systems v3（boldsystems.org）数据库进行BLAST比对，获得最相似物种信息。利用MEGA 6.0对获得的单倍型序列进行分析，基于Kimura-2-parameter模型使用Neighbor-Joining法构建系统发育树，bootstrap值设定为1 000次重复。

2.3 结果分析

2.3.1 基于形态的初步鉴别 商品海龙药材除小海龙和六角海龙外均有去除皮膜和未去皮膜的类型，由于是否去皮膜仅影响商品药材表面颜色和纹理特征，不影响棘棱数、头部形态或骨环数等，可明显将去皮膜和未去皮膜的同种药材归于一类。商品海龙药材形态上根据躯干部棘棱数和体型大小可明显分为5大类：1）四棱形的拟海龙类（三角海龙）；2）五棱形的刁海龙类（刁海龙）；3）六棱形的宝珈海龙类（六角海龙）；4）柱状六棱形的粗吻海龙类（粗吻海龙、海蛇或黑海龙）；5）细长呈鞭状的尖海龙类（小海龙、尖海龙或海针）。同类海龙仅骨环数、吻长、体表棘刺有无，形态大小等具有可定性的区别，背鳍、胸鳍等数目难以准确测量，差异不显著。为确定市售海龙药材基原，本研究对所有样品的COI片段进行扩增、测序及比对分析。

2.3.2 PCR和DNA序列分析结果 使用试剂盒提取的海龙类样品总DNA浓度均大于10 ng/μL，OD260/280在1.5左右，符合中华中医药学会团体标准“T/CACM 010-2016中药分子鉴别通则”的基本要求。使用COI1490/2198通用引物和條件进行PCR扩增其条带较弱，部分刁海龙类样品无法获得阳性条带，总测序成功率为66.12%，无法获得序列的样品经由鱼类通用引物对Fish1.F/Fish1.R和Fish2.F/Fish2.R进行重扩增测序，经程序调整后均可获得DNA序列。以3对引物的最小共有PCR扩增产物序列为最终序列，进行BLAST比对及系统发育树分析。126条序列长度均为649 bp，共获得68种单倍型，BLAST比对结果见表3。除单倍型Hap17～Hap23、Hap33、Hap34、Hap38、Hap66～Hap68外，利用NCBI和BOLD数据库鉴别结果均一致，各单倍型序列所对应的物种分别为宝珈枪吻海龙、粗吻海龙、刁海龙、多棘刁海龙、拟海龙、舒氏海龙等6种。为进一步确定各单倍型尤其是两数据库比对结果不一致的单倍型所对应的物种，对单倍型序列比齐后进行系统发育树分析。

从Genbank数据库中选择海龙科不同种属序列为参照序列，与所获得的单倍型序列一起，使用BioEdit软件进行序列对齐后一同构建系统发育树，海龙类单倍型序列共可分为6大支。见图1。21种单倍型与粗吻海龙聚为一类，13种单倍型与拟海龙聚为一支，4种单倍型与刁海龙聚为一支，2种单倍型与多棘刁海龙聚为一支，5种单倍型与宝珈枪吻海龙聚为一支，12种单倍型与舒氏海龙聚为一支，另有11种单倍型单独分为5支，与BLAST结果相一致。其中单倍型Hap17、Hap18聚为一支，与单倍型Hap19～Hap22及粗吻海龙共同聚为一大支；单倍型Hap32、Hap33聚为一支，与单倍型Hap66及刁海龙共同聚为一大支；单倍型Hap67、Hap68与黄带冠海龙Corythoichthys flavofasciatus聚为一支。为进一步确定各单倍型所对应的物种，对未能鉴别到种的样品依据对应分类学文献进行全属物种性状比较。

2.3.3 DNA和形态结合的商品海龙基原分析 单倍型Hap32、Hap33、Hap66以超过95%的支持度与刁海龙属为一支，根据Dawson的文献[15]进行形态鉴别，依据其骨环、尾部颜色、体表斑纹特征确定单倍型Hap32、Hap33对应物种为黑斑刁海龙（Solegnathus lettiensis）、单倍型Hap66对应物种为斗氏刁海龙（Solegnathus dunckeri）。以相同的方式，确定单倍型Hap17、Hap18、Hap19、Hap20、Hap21、Hap22为粗吻海龙属物种序列，根据Dawson的文献[16]进行形态鉴别，粗吻海龙属仅有3个物种，依据其吻长、体宽、眼径、骨环数特征确定单倍型Hap17、Hap18对应物种为长吻粗吻海龙（Trachyrhamphus longirostris），单倍型Hap19～Hap22对应物种为光粗吻海龙（Trachyrhamphus bicoarctatus）。单倍型Hap67、Hap68均与黄带冠海龙（C.flavofasciatus）聚为一支，然而其体环上缘有细棘齿，体褐色有不明显横带，吻背中央隆起嵴有锯齿，与黄带冠海龙不符而与葛氏海蠋鱼（Halicampus grayi）相一致。分类上曾将葛氏海蠋鱼处理为黄带冠海龙的亚种（Corythoichthys flavofasciatus conspicillatus），序列有很高的相似性，推断单倍型Hap67、Hap68对应物种为葛氏海蠋鱼。

DNA序列分析结果表明商品名六角海龙基原物种为宝珈枪吻海龙，商品三角海龙基原物种为拟海龙，商品小海龙、尖海龙、海针的基原物种均为舒氏海龙，DNA鉴别结果与形态鉴别结果完全一致。商品刁海龙共有4种不同基原，分别为刁海龙、多棘刁海龙、黑斑刁海龙和斗氏刁海龙，除多棘刁海龙外，其余3种海龙均符合2015年版《中华人民共和国药典》的性状描述，但均非《中华人民共和国药典》海龙基原物种。其中斗氏刁海龙形态与2015年版《中华人民共和国药典》规定的刁海龙形态最为相似，仅尾部骨环形态具有区别，斗氏刁海龙尾部为平行的双行骨环，刁海龙为单行骨环。商品海蛇、粗吻海龙、黑海龙商品为同一类，腹部均为柱状六棱形，其基原物种包括粗吻海龙、光粗吻海龙、长吻粗吻海龙和葛氏海蠋鱼，主要区别为吻长和骨环数，其中光粗吻海龙体细长，吻长1.2～2 cm，尾部骨环55节以上；长吻粗吻海龙体粗壮，吻长0.6～1.1 cm，吻背具小棘而呈锯齿状，尾部骨环41～50节；粗吻海龙体粗壮，吻长0.4～0.8 cm，尾部骨环41～50节；葛氏海蠋鱼体粗壮，吻短，眼眶大而突出，尾部骨环32～37节。

2.3.4 海龙商品的快速性状鉴别 目前《中华人民共和国药典》中海龙性状项较为简略，无法完全区分正品和同属混伪品，而《中国海洋鱼类》等分类学著作仅关注原动物形态，其重要鉴别特征如体表颜色、棘棱位置、背鳍、胸鳍、尾鳍形态、骨环的数目在部分干燥的海龙药材中难以准确测定或发生改变，无法准确对海龙进行基原鉴别。故而本研究筛选出海龙商品药材特征性鉴别点（表4），以达到快速性状鉴别目的。

3 讨论

3.1 市售海龙商品基原及其流变 本研究对主要中药材市场购买的126批海龙商品进行DNA提取，并进行性状鉴别和DNA序列分析，结果表明，126批海龙基原物种有刁海龙（14批）、多棘刁海龙（14批）、黑斑刁海龙（14批）、斗氏刁海龙（2批）、宝珈枪吻海龙（14批）、粗吻海龙（14批）、光粗吻海龙（14批）、长吻粗吻海龙（14批）、拟海龙（14批）、葛氏海蠋鱼（2批）和舒氏海龙（16批）。其中黑斑刁海龙、斗氏刁海龙、光粗吻海龙、长吻粗吻海龙为首次在中药市场上发现，表明近年来海龙商品基原已开始发生较大的流变。在商品标为刁海龙的样品中，多棘刁海龙所占比例与前期相比有所减少[2]，但出现了2种新的混伪品黑斑刁海龙和斗氏刁海龙。市场中多家商户将刁海龙样品直接标注为澳洲海龙，由于刁海龙和黑斑刁海龙主产南海海域和澳大利亚海域，斗氏刁海龙产澳大利亚海域，市场上的刁海龙也有可能是从澳大利亚进口而来，表明我国海龙药材进口压力有所增加，也反映了我国海龙资源减少的现状。亳州、安国等多个药材市场的海龙商品中粗吻海龙类已占主流，且从单一的粗吻海龙发展为粗吻海龙和光粗吻海龙并重，并有长吻粗吻海龙和葛氏海蠋鱼混入，显示出海龙商品物种基原的复杂化。此外，本研究还发现，市场所称尖海龙、海针、小海龙的样品均非正品尖海龙，其基原均为海龙属舒氏海龙。虽然本研究仅收集到16批尖海龙类样品，不代表所有市场产品的基原，但其结果也对以海龙入药的中药饮片和中成药质量提出警示。税丕先、丁维毅等[6-7]认为，海龙商品的基原物种还有蓝海龙、低海龙和冠海龙，但均為稀见种，本研究搜集的样品未出现，可能是多年来市场品种发生改变的结果。

3.2 分子鉴别用于中药商品市场调查 中药商品的市场调查是正本清源，确定鉴别和监管目标的前提条件。随着中药资源需求量扩大，资源蕴含量减少及中药国际贸易的进一步深化，市场地方习惯用药品种、民间药和民族药种类以及进口药材的呈现增加的趋势，中药材商品的物种基原日趋复杂，形态鉴别对于性状极为相似的近缘物种鉴别日趋困难。分子鉴别方法有望提高中药商品市场调查的结果准确性和稳定性，是传统市场调查的重要工具和有效补充。温莲珑等[17]对市售海马商品物种基原进行分析，通过形态鉴别分为13个物种，而经DNA序列分析后修订10个物种。本研究也发现粗吻海龙、光粗吻海龙和长吻粗吻海龙DNA序列存在巨大差异，而其形态非常相似，极易混淆。基于DNA分子鉴别的手段，可以准确识别中药商品出可能存在的非药典收载基原物种，确定市场的混伪情况，贾静等[18]对市售鹿茸粉进行COI测序，发现62%的商品为驯鹿基原；Newmaster等[19]使用rbcL+ITS2片段对北美12家公司中药材产品进行测序，发现59%的商品中含有未在标签上列出的物种；蒋超等[20-21]使用PCR-RFLP、DNA测序和CCP-FRET荧光标记对我国药店、医院和饮片生产企业的鹿茸和川贝母饮片进行检测，发现67.8%的川贝母和52.8%的鹿茸均含有混伪品，市售鹿茸基原物种包括驯鹿、骡鹿、白唇鹿和麋鹿等。但仅通过DNA序列分析或形态鉴别均进行物种基原鉴别均存在一定的局限性。受限于核酸序列数据库的准确性和完备程度，部分样品进行比对时仅在属这一层级具有高的支持度（>95%），在物种层级则容易出现错误。见表2、图2。而在确定属的情况下，通过对标本和图片进行核对，可以进一步确定其基原物种。

将分子鉴别手段和形态鉴别结合品种鉴别的步骤如下：通过广泛采集有代表性的商品药材→对样品进行DNA提取和标准片段测序→分析单倍型的种类，进行序列比对从而确定商品药材所对应的属→对照样品的模式标本、模式图片或分类学文献，根据分类特征确定基原物种。在必要时，可以取经过确证动植物标本进行测序，与所获得的单倍型序列进行比对，进行交叉验证是否为同一物种。进而，在确定市场基原物种的情况下，根据各同类药材的共有特征，总结出核心鉴别点，将进一步规范中药商品市场，提高中药质量标准。

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