木薯叶片中黄酮醇类物质的提取与检测

王琴飞，吴秋妃，徐 缓，林立铭，张振文

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)

木薯亦称树薯(ManihotesculentaCrantz)，与马铃薯、甘薯并列为世界三大薯类作物。我国木薯种植主要集中在广西、广东、云南和海南等省区。木薯块根是生物能源和淀粉加工的重要原料，而茎秆、叶片是其主要的副产物[1]。虽然木薯叶片饲料化利用是重要的途径之一，但由于其含有大量的氰化物、植酸等抗营养因子，制约了木薯叶的推广利用[2]。因此，研究者指出，通过提取分离木薯叶活性物质的药用价值，是开发木薯叶药用价值的又一途径[1, 3-4]。

研究表明，木薯叶中不仅含有丰富的类胡萝卜素，黄酮类物质含量也很高[3, 5]。黄酮类化合物具有消除氧自由基、调节血脂、抗肿瘤、抗病毒等生理活性[6]。研究人员发现木薯叶经捣烂、煮熟后食用，不仅可以作为蔬菜食用，可以治疗膀胱炎，并且孕妇和哺乳期的妇女都可以食用，因此推测木薯叶的药效与其活性物质有关[3, 7]。目前为止，在木薯叶中发现了8种黄酮类化合物，分别是芦丁、烟花甙、槲皮素、山奈酚、三羟基黄酮醇、金丝桃苷、剌槐甙、水仙甙。其中芦丁和烟花甙是木薯叶中的主要活性物质[8]。Isao Kubo等[8]发现，巴西木薯叶片黄酮类化合物槲皮素、山奈酚、芦丁含量分别达到了840、840、4620 mg/kg， 并且这3种化合物的抗氧化性效果显著。我国研究者也对木薯叶黄酮类物质的提取分离、生物活性鉴定等进行了探索研究[4, 9-11]，而在黄酮类物质的定性定量分析方面研究较少，何翠薇等[12]对木薯叶中芦丁的提取方法和HPLC检测方法进行了系列研究，发现不同采收期木薯叶片中芦丁含量存在较大差异，但木薯叶中多个黄酮类物质的定性定量分析还未有详细的研究报道。因此，本研究以木薯叶片为材料，期望通过提取方法和色谱条件的优化， 建立一个快速提取木薯叶黄酮醇类物质和同时分析多个黄酮类物质的HPLC方法，为木薯叶的资源化利用及质量评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器设备

木薯叶片于海南儋州国家木薯种质资源圃采收，采集后迅速在60 ℃水浴锅中脱氰处理10 min，沥干水分，在60 ℃的烘箱内烘干8 h，最后用植物粉碎机粉碎后过100目筛，样品粉末保存于-8 ℃冰箱待用。根据文献采集不同品种的幼叶、嫩叶和成熟叶，幼叶为顶部向下1～4片叶，嫩叶为顶部向下4～8片叶，成熟叶为顶部向下8～12片叶。

标准样品芦丁、烟花苷、槲皮素和山柰酚(纯度≥98.0 %)购买于上海融合医药科技发展有限公司。甲醇为色谱纯，购买于美国Sigma公司。无水乙醇、磷酸等为分析纯。

采用Agilent1260型液相色谱系统分析黄酮类物质，配备自动进样器(型号:G1329B)、二极管阵列列检测器(型号:G1315D)和柱温箱(型号：G1316A)。色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美国Agilent1260公司)；超纯水由Elix3+Synergy超纯水系统制备，购买于美国Millipore公司；烘箱(型号FD115)购买于德国BINDER公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木薯叶黄酮醇的提取 取木薯叶粉末的0.2000 g于三角瓶中，加入40 %的乙醇15.0 mL，旋涡振荡混匀，超声提取30 min(70 ℃，4 kHz)，待样品冷却后，用40 %的乙醇补重，转移至50 mL离心管中，离心10 min(10 000 r/min，25 ℃)；上清液即为待测液，放置于4～8 ℃冰箱待测。每个样品重复3次。

1.2.2 色谱条件 利用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇(A)和0.2 %磷酸水(B)溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：起始为40 % A， 60 % B；到15 min时A为58 %， B为42 %； 20 min时A为80 % ，B为20 % ，到22 min时A为40 % ，B为60 %，平衡柱子5 min，进下一个样；流速为0.8 mL/min；检测波长为360 nm；进样量10 μl；柱温40 ℃。所有样品进样前经0.22 μm 微孔滤膜过滤。采用外标法定量。

1.2.3 标准溶液的配制与标准曲线的制作 分别称取适量的芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚标准样品，用色谱甲醇配制成质量浓度分别为1.0、2.1、3.0、4.0 mg/mL单标母液保存于-20 ℃，再用色谱甲醇稀释依次稀释配制成不同浓度的混合标准溶液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后使用。将混合标准溶液进样分析，以峰面积(mV)为纵坐标(y)，标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标(x)，制作标准曲线并进行线性回归分析。

1.2.4 仪器精密度试验 任意选取一个标准样品溶液，进样10 μl，按1.2.2的色谱条件连续进样6次，测定芦丁的峰面积，考察仪器的精密度。

1.2.5 方法重复性试验 随机选择一个样品，重复进样6次，计算样品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚峰面积变化的RSD值，考察检测方法的重复性。

1.2.6 样品稳定性试验 任意选择一个加标样品，在室温下放置，每隔4 h测定其响应值，计算木薯叶片样品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚浓度变化的RSD值，考察样品在24 h内的稳定性。

1.2.7 样品的加标回收实验 准确称取木薯叶片粉末0.2 g左右，按高、中、低3个浓度水平加标，每个水平重复3次，按1.2.1提取方法，利用40 %的乙醇溶液提取芦丁和烟花苷，80 %的乙醇溶液提取槲皮素和山奈酚，进行回收率和准确度实验，由回归方程计算样品浓度，并计算样品平均回收率和标准偏差。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

据报道，木薯中黄酮类物质的提取效果受提取溶剂的比例，料液比影响较大，超声时间和提取温度影响较小[11]。因此，在本实验中仅考察了乙醇比例和料液比对木薯叶黄酮醇物质的影响，以此确定最佳的提取条件。

2.1.1 乙醇比例的影响 在0.2 g木薯粉末中，加入10 mL 比例分别为10 %～100 %的乙醇溶液。在70 ℃条件下超声提取30 min，考察乙醇比例对4种黄酮醇物质提取效果的影响。如图1所示，在木薯叶片中检测到芦丁，烟花苷和槲皮素3种黄酮醇类物质，不同的乙醇浓度，3种黄酮醇物质的的提取效率不同，其中，40 %～50 %的乙醇浓度有利于芦丁和烟花苷的提取，2种物质都在乙醇比例为40 %时提取量达到最高，含量分别达到5222.3、1036.2 μg/g；而70 %～80 %比例的乙醇有利于槲皮素的提取，最高提取量达到11.4 μg/g。在所有提取样品中未检测到山柰酚。结果表明，木薯叶片中黄酮醇类物质以黄酮苷类芦丁和烟花苷为主。

2.1.2 料液比的影响 在0.2 g木薯粉末中，分别加入5～30 mL 40 %的乙醇溶液。在70 ℃条件下超声提取30 min，考察料液比对黄酮醇物质提取效果的影响。如图2所示，随着提取溶剂体积的增加，检测到3种黄酮醇物质，虽然料液比为1∶75(g/mL)后槲皮素的含量差异不显著，但根据3种黄酮醇含量最大值显示，在料液比为1∶75(g/mL)时，芦丁、烟花苷和槲皮素提取量时达到最高，含量分别为5233.9、1039.9和11.2 μg/g。因此选择料液比1∶75提取木薯叶中3种黄酮醇物质会更佳，使用溶剂相对较少。

图2 不同料液比对黄酮醇提取效果的影响Fig.2 Effect of liquid/solid on the extracting flavonols from cassava leaves

图3 标准样品和加标样品中黄酮醇物质的色谱图Fig.3 Chromatograms of flavonols in standard and sample

2.2 色谱条件的优化

在200～600 nm范围内对芦丁、烟花苷、槲皮素和山柰酚的混合标样溶液进行紫外扫描，4种黄酮醇物质在此波长范围内有两个特征吸收高峰，最大吸收峰分别在356、348、372和366 nm。因此，实验选择360 nm为检测波长，参比波长设为450 nm。同时，为了获得4个物质的最佳分离效果，在文献报道基础上[14]，对流动相比例和磷酸水溶液的酸度进行调节。结果表明，利用0.2 %的磷酸水溶液进行样品的分析，芦丁和烟花苷在样品中出峰不拖尾，峰形较好。如图4所示，芦丁、烟花苷、槲皮素和山柰酚的保留时间分别为8.305、10.792、14.925和19.164 min，加标样品中4种黄酮醇物质出峰时间与标准样品一致。

2.3 方法的线性关系和检出限

如表1所示，4种黄酮醇的线性关系良好，相关系数(R2)分别达到了0.9996、0.9999、0.9992和0.9995。以标准溶液逐级稀释，按3倍信噪比(S/N)，确定四种黄酮醇物质的检出限(LOD)分别为0.10和0.10、0.04和0.02 μg /mL。

2.4 仪器精密度

以芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚的混合标准样品，利用上述色谱条件连续进样6次，以4种黄酮醇的响应值变化，考察该仪器的精密度，四种黄酮醇物质的平均峰面积分别为2511.8、396.2、19.9和16.3 mV，相对标准偏差分别为0.01 %、0.14 %、0.63 %和3.12 %。说明该仪器精密度良好。

2.5 方法重复性

选择一个加标样品，重复进样5次，芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚平均峰面积分别为7132.59、1637.09、784.12、1018.95 mV，峰面积变化的相对标准偏差分别为1.33 %、2.12 %、1.36 %和1.32 %，表明该检测方法的重复性较好。

2.6 样品稳定性

24 h内6次进样分析(表2)显示，芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚平均质量浓度分别为6791.7、1654.1、101.4和71.4 μg/g，浓度变化的RSD分别为0.11 %、0.40 %、1.92 %和1.72 %，样品中的4种黄酮醇含量变化<2.00 %，表明24 h内样品中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚稳定性较好。

2.7 加标回收实验

样品加标实验(表3)表明，芦丁的回收率在90.81 %～99.90 %，平均回收率为98.47 %，相对标准偏差(RSD)为2.84 %；烟花苷的回收率在88.35 %～92.76 %，平均回收率为90.81 %，相对标准偏差(RSD)为2.25 %；槲皮素的回收率在93.57 %～98.27 %，平均回收率为96.55 %，相对标准偏差(RSD)为2.6 %；山柰酚的回收率在98.57 %～100.6 %，平均回收率为99.83 %，相对标准偏差(RSD)为1.1 %；表明本方法的准确度较高，能够满足样品测定需要。

表1 黄酮醇类物质的线性、检出限

表2 木薯样品中黄酮醇的的稳定性

表3 样品中黄酮醇类物质的平均回收率和相对标准偏差

注： “-” 表示未检测到。

Note: ‘-’， Not detect.

2.8 不同品种木薯叶片中黄酮醇物质的检测

利用已建立的提取和检测方法，考察了三个木薯品种不同生育期木薯叶片中黄酮醇含量。数据分析表明(表4)，3个品种不同生育期的木薯叶片中，芦丁、烟花苷和槲皮素在嫩叶期含量最高，热引1号中含量分别为7503.4、8330.1和9.4 μg/g，SC09中含量分别为10 155.9、4992.8和9.1 μg/g；SC12中仅检测到芦丁和烟花苷，含量分别为4298.2、6171.7 μg/g。不同品种木薯叶片中3种黄酮醇总含量都呈现：嫩叶>成熟叶>幼叶的趋势；热引1号、SC09和SC12 3个品种嫩叶期黄酮醇总量分别为15 843 μg/g、15 157.8和10 460.9 μg/g。在考察的品种中，嫩叶期的黄酮醇类物质总含量最高为热引1号；芦丁含量最高为SC09；烟花苷含量最高为热引1号。不同品种、不同生育期木薯叶片中黄酮醇含量差异较大，黄酮类物质在木薯叶中主要以糖苷类物质芦丁和烟花苷存在，槲皮素微量或检测不到，而山奈酚在考察的品种中都未检测到。证明该方法能准确的对不同品种木薯叶片中黄酮类物质进行分析评价。

3 讨 论

木薯叶中黄酮醇类物质的提取方式很多，提取方法各有优缺点。有机溶剂提取时间较长[11]，溶剂用量也大；碱提取法[9]虽然可以去除样品中的氰化物，但提取率不高；减压法[4]提取效果比超声效果好，但是效率不高，操作繁琐；超声提取是目前天然产物提取常用的方法[10]，该方法具有省时、节能，可避免常规提取法对热敏性物质的破坏，溶剂用量也少，能在短时间能进行大量样品的提取。本实验选择超声提取30 min，可有效提取木薯叶片中黄酮醇类物质。甲醇和乙醇是常用的黄酮类化合物提取溶剂，高浓度的醇适宜于提取苷元，50 %左右的乙醇或甲醇水溶液适宜提取苷类[13]，本实验也发现芦丁和烟花苷在乙醇比例40 %～50 %提取效果最好，而槲皮素和山柰酚在乙醇比例为70 %～80 %时提取效果较好。陶海腾等的研究表明，黄酮物质的提取率受乙醇浓度和料液比影响较大，受提取温度和时间影响较小，本实验仅对乙醇浓度和料液比提取效果进行了比较。结果显示，料液比越高，越有利于黄酮醇物质的提取，但料液比越高，损耗的提取溶剂就越多，因此，考虑不同成分的提取效率的情况下，后续的实验选择了40 %和80 %乙醇水溶液，料液比1∶75(g /mL)，分别对苷类(芦丁和烟花苷)和苷元(槲皮素和山奈酚)进行提取检测，而提取温度选择黄酮类物质提取的常用温度70 ℃[10]。

表4 不同品种木薯叶片中黄酮醇含量

注： “-” 表示未检测到。

Note: ‘-’， Not detect.

何翠薇等利用高效液相色谱技术，利用甲醇-0.1 %或0.4 %的磷酸水溶液等度洗脱的方法，对不同采收期木薯叶片中芦丁的含量进行了定量分析[4, 12]。本研究在此基础上，对流动相和洗脱程序进行优化，发现流动相以甲醇-0.2 %的磷酸水溶液梯度洗脱22 min，可实现4种黄酮醇的基线分离；通过精密度、稳定性、重复性与加标回收试验等方法学考察，证明该方法简便、可行，可以实现了芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚4种黄酮醇物质的同时检测。

此外，本实验进一步对不同品种和生育期木薯叶进行样品验证，发现木薯中含有大量的芦丁和烟花苷，少量的槲皮素；不同品种不同生育期的木薯叶片黄酮醇物质含量差异较大；同时，结果验证了木薯叶中黄酮类物质差异与采收期、品种等有关[12, 14]，并且发现不同品种的木薯叶，嫩叶期3种黄酮醇物质含量最高，研究结果将为木薯叶黄酮类物质的利用提供参考。

4 结 论

以40 %和80 %的乙醇水溶液，在料液比为1/75(g/mL)条件下，可快速有效提取木薯中4种黄酮醇物质，利用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱，以甲醇—0.2 %磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min；检测波长为350 nm，22 min内可实现4种黄酮醇物质的有效分离。通过精密度、稳定性、重复性与加标回收试验等证明， 该方法准确度、 精密度、 重复性较好， 能满足不同木薯品种叶片中芦丁、烟花苷、槲皮素和山奈酚含量的同时测定，该方法可作为木薯叶黄酮醇物质含量的测定方法。