大蒜素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡及细胞周期的影响

郭燕军 ，刘洪利 ，陈 勇，闫 威 ，温 凯

（1.沧州市中心医院口腔颌面外科，沧州 061001；2.沧州医学高等专科学校，沧州 061000）

大蒜素是一种天然存在的二烯丙基三硫化物，近代药理学研究发现大蒜素能够通过促进肿瘤细胞凋亡、影响细胞周期等不同作用机制对卵巢癌、宫颈癌、胃癌等起到一定的抑制作用[1-3]，而大蒜素是否能够促进舌鳞状癌细胞凋亡并影响其细胞周期尚未见文献报道，本研究将通过体外培养人舌鳞状癌Tca8113细胞并给予不同剂量大蒜素进行干预，探讨大蒜素对舌鳞状细胞癌细胞凋亡和细胞周期的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、药物与试剂 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株由河北医科大学病理生理学教研室惠赠。大蒜素注射液购自黑龙江迪龙制药有限公司[规格：2 mL（30 mg）]；注射用顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司[规格：6 mL（30 mg）]；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自德国Bendermed公司；B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关 X 蛋白（Bax）引物购自上海博亚生物公司；cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2多克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 实验用细胞株经解冻复苏后体外培养，取处于对数生长期的细胞，调整细胞密度为5×104/mL，继续培养24 h后，设空白对照组、大蒜素（50、25、12.5μg/mL）组和顺铂（40μg/mL）组，每组设12个复孔，给药干预48 h后行各指标检测。

1.2.2 细胞周期及细胞凋亡检测 采用流式细胞术：各组细胞经1 000 r/min离心5 min后弃上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次后，加5 mL浓度为70%乙醇混匀，4℃环境放置48 h后，离心去除乙醇，PBS洗涤3次，加5μL浓度为10 mg/mL水解酶Rnase，1 h后加入浓度为100μg/mL的碘化丙啶染液，室温避光孵育30 min后通过流式细胞仪进行分析检测，采用CELLQuest软件分析细胞周期时相及凋亡状况。

1.2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达检测 采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法：查阅大鼠Bcl-2、Bax、内参β-actin基因cDNA序列并设计上、下游引物，常规消化并收集各组细胞，加入适量TRIzol试剂提取总RNA，测定总RNA浓度，取1μg RNA反转录为cDNA，然后进行PCR反应，扩增完毕后，取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察并照相。根据条带灰度值，以β-actin为内参半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达并计算Bax/Bcl-2值。

1.2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表达的检测 采用蛋白免疫印迹法：超声碎裂细胞，经12 000 r/min低温（4℃）离心20 min处理后取沉淀，BCA法行蛋白定量后实施高温蛋白变性，电泳：待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、丽春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2、β-actin（1∶500）4 ℃过夜；洗膜，二抗（1∶100）室温摇床上孵育1 h后经ECL显色。根据条带灰度值，以β-actin为内参半定量分析cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表达。

1.3 统计学处理 运用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料采用均数±标准差）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡状况Fig.1 Apoptosis of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

2 结果

2.1 细胞周期检测结果 大蒜素（50、25μg/mL）组和顺铂组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞处于DNA合成前期（G0/G1）期比例较空白对照组显著降低而DNA合成后期（G2/M）期比例显著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示大蒜素能够阻滞Tca8113细胞有丝分裂；与顺铂组比较，大蒜素50μg/mL组Tca8113细胞G2/M期比例显著升高（P＜0.05），两组间G0/G1期差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞细胞周期（Tab.1 Cell cycle of human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group（%

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.05。

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2.2 细胞凋亡检测结果 大蒜素（50、25、12.5μg/mL）组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡率为（73.1±8.6）%、（45.8±6.7）%、（21.3±5.9）%，顺铂组为（28.8±4.5）%，与空白对照组（2.4±1.5）%比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；与顺铂组比较，大蒜素（50、25μg/mL）组Tca8113细胞凋亡率显著升高（P＜0.05或 P＜0.01）。结果见图 1。

2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA检测结果 与空白对照组比较，大蒜素（50、25、12.5 μg/mL）组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bcl-2 mRNA表达显著下调（P＜0.05 或 P＜0.01），大蒜素（50、25 μg/mL）组 Bax mRNA表达显著上调、Bax/Bcl-2比值显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与顺铂组比较，大蒜素50μg/mL组Bcl-2 mRNA表达显著下调、Bax/bcl-2比值显著升高（P＜0.05）。结果见表 2。

表2 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表达和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表2 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表达和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.05。

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表3 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表达Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表3 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表达Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与顺铂组比较，#P＜0.05。

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2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表达检测结果 大蒜素（50、25μg/mL）组和顺铂干预组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞cyclin B1蛋白、CDK1蛋白较空白对照组显著上调，cyclin D1蛋白、CDK2蛋白显著下调，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与顺铂组比较，大蒜素50μg/mL组cyclin B1表达显著上调（P＜0.05），CDK2表达显著下调（P＜0.01），两组间 cyclin D1、CDK1 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2和表3。

3 讨论

口腔颌面部肿瘤占全身恶性肿瘤10%左右，其中口腔鳞癌最为多见。舌鳞状细胞癌占口腔癌40%左右[4]，具有生长快、浸润性强、转移率高、预后差的特点[5]，严重危害着人类的生命健康。目前，临床上采用常规手术切除结合术前术后化疗的治疗方案，但治愈率仅30%左右，化疗耐药性的产生是疗效降低并最终导致舌鳞状细胞癌复发的主要原因。因此，迫切需要研究高效、低毒、敏感性高的新型抗肿瘤药物。

图2 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表达Fig.2 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

大蒜素是一种天然存在的二烯丙基三硫化物，既往张飞凤等[1]、刘玲等[2]、佘玉清等[3]研究发现大蒜素具有抑制卵巢癌SKOV-3细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌MKN-45细胞生长，且具有时间和剂量依赖性，其作用机制可能与大蒜素能够通过破坏细胞结构、阻滞细胞有丝分裂、抑制细胞增殖等有关。本实验研究发现：经大蒜素干预能够阻滞细胞周期于G2/M期而抑制细胞有丝分裂，提高细胞凋亡率；并且与顺铂组比较，大蒜素50μg/mL组Tca8113细胞G2/M期比例显著升高。

Bcl-2基因家族Bcl-2、Bax是细胞凋亡过程中重要的调控基因，其中Bcl-2能够抑制细胞色素C释放、抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）激活、调节细胞内钙浓度，从而表现出抑制细胞凋亡的作用[6]；Bax具有破坏线粒体渗透性、激活Caspase-3而表现出促细胞凋亡作用[7]；Saeedi Borujeni MJ等[8]研究发现Bax与Bcl-2能够聚合成二聚体，从而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2比值更加能够体现两者对细胞凋亡的实际调控作用。本实验研究发现：经大蒜素干预能够显著下调人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bcl-2mRNA表达、上调BaxmRNA表达而显著提高Bax/Bcl-2比值，这可能是大蒜素诱导Tca8113细胞凋亡的重要分子机制之一。

细胞周期过程有多种基因蛋白参与调控，其中周期蛋白依赖性激酶CDK2是细胞周期G2期运行的必要因子，而CDK1则调控肿瘤细胞从G2期过渡到M期，从而使细胞进入细胞分裂周期[9]。周期相关调控蛋白周期蛋白Cyclin B1是G2/M期的重要调控蛋白，Cyclin B1能够与CDK1组成促有丝分裂因子（MPF），MPF能够促使细胞G2期过渡到M期。本实验研究发现：经大蒜素干预能够显著上调人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞cyclin B1蛋白和CDK1蛋白表达，显著下调cyclin D1蛋白和CDK2蛋白表达，这可能是大蒜素通过阻滞细胞有丝分裂而抑制Tca8113细胞增殖的重要分子机制。

综上所述，大蒜素可能通过促进细胞凋亡、阻滞细胞有丝分裂而对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞生长起到一定的抑制作用，其分子机制可能与大蒜素影响凋亡相关调控基因（Bcl-2、Bax）及细胞周期相关调控蛋白（cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2）表达有关。