青海湖裸鲤肠道乳酸菌多样性与抗生素抗性的研究

王露莹，齐博文，赵晨曦，崔美岩，谈重芳

（郑州大学物理工程学院 郑州 450001）

0 引 言

乳酸菌是革兰氏阳性菌，可发酵可溶性碳水化合物产生乳酸、乙酸，广泛存在于人和动物肠道、植物表面、发酵乳制品、酸泡菜、青贮饲料等环境中，在食品加工中具有悠久的应用历史，被公认为安全性菌株(Generally regarded as safe，GRAS)[1]。由于乳酸菌对人体健康有着重要的作用，近年来其相关食品行业迅速发展。

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)俗称“湟鱼”，属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，裸鲤属(Gymnocypris)，是青海湖中重要的经济鱼类，处于青海湖整个生态系统的核心地位[2]。虽然抗生素作为饲料添加剂具有巨大的经济效益，但它在长期使用中会造成病原体的突变、引起抗药性等问题，使用已受到了严格的限制。而另一方面乳酸菌作为保健、提高免疫类产品，作用效果也得到逐步的认可，但在实际生产中，其不能完全替代抗生素的作用，需要将二者配伍使用才能发挥最好的效果[3]。无论是内源益生乳酸菌还是外源乳酸菌都无法避免和抗生素的正面接触，因此开展益生菌对抗生素的敏感性研究很有价值[4]。现阶段对青海湖裸鲤肠道益生菌的研究比较空缺，本文就青海湖裸鲤肠道乳酸菌的生理生化特性以及抗生素敏感性进行了分析，为青海裸鲤肠道益生菌的开发与利用提供支持。

1 实验

1.1 试剂与仪器

DNA提取试剂盒。PCR扩增仪，凝胶成像仪，电泳仪等。

1.2 培养基

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸钠5.0 g，吐温80 1.0 mL-1，磷酸氢二钾 2.0 g，柠檬酸铵2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g。NA培养基(g/L)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g。CLO培养基(g/L)：蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨7.5 g，酵母膏7.5 g，牛肉膏7.5 g，柠檬酸铁铵1.0 g，亚硫酸氢钠1.0 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.75 g。以上培养基pH值均为6.5～7.0。固体培养基琼脂粉加入量质量浓度为17 g/L。PDA培养基加入质量分数为10%的酒石酸[5]。

1.3 样品的采集

2014年10月份从青海湖采集裸鲤样品，样品来源及其重量如表1所示。

表1 青海湖裸鲤样品采集情况

1.4 样品的处理

新鲜的鱼肠用无菌剪刀切碎后取5 g放入45 mL无菌水中，用漩涡振荡器振荡30 s，按10-1，10-3，10-5的稀释梯度各取20μL涂布在MRS，PDA，EMB，NA培养基中；将1 mL10-1和10-2样品稀释液75℃水浴15 min后涂布在NA及CLO培养基上，每个样品做个平行。30℃倒置培养48 h，MRS及CLO培养基放置于厌氧培养箱。对MRS平板进行菌落计数，根据菌落大小、形态和颜色等特征，挑取单菌落在MRS培养基上划线纯化2次，-80℃下保存在10%二甲基亚砜NB培养基中备用[6]

。

2 生理生化性质的检测

2.1 形态特征

用肉眼直接观察培养基上疑似菌落的形态、大小、色泽和突起等。用革兰氏染色（革兰氏阳性或革兰氏阴性）实验的方法在显微镜下仔细观察染色结果和细胞形态。

2.2 生理特征

代表株的生理生化性状检测包括耐盐(NaCl)浓度、pH值生长范围、温度生长范围实验等[7]。

2.2.1 pH值范围生长测定

用浓度为1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠调节MRS液体培养基，使其p H值为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0。分别用这些培养基进行代表株接种实验，放置到30℃的恒温培养箱中培养7 d。其中p H=6.5的培养基作为对照组。

2.2.2 耐盐质量分数测定

将菌株分别接种于NaCl质量分数为3.0%和6.5%的MRS液体培养基（pH值为6.5）中，并放置到30℃的恒温培养箱中培养两天。无NaCl的MRS液体培养基作为对照组。

2.3 生化特性

代表株的生化特性测定包括：过氧化氢酶实验、发酵葡萄糖产气实验(同型或异型发酵实验)。

3 菌株的分子生物学检测

3.1 菌落PCR

将菌株接种在MRS固体培养基上厌氧培养48 h，挑取单菌落进行PCR扩增，引物选用细菌的16S rRNA基因扩增的通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCT TGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为50μL：Premix Taq25μL,27F和1492R(浓度均为20 mmol/L)1 mL，补充灭菌蒸馏水至50μL，用10μL无菌枪头在单菌落挑取少许，加入反应体系，进行PCR扩增。待扩增完成后，在1%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后，用EB溶液染色，在紫外凝胶成像系统下观察[8]。

3.2 16SrRNA基因序列分析

将PCR产物送到华大基因公司测序，将测序所得长度约1 500 bp左右的16S rRNA基因序列在GeneBank中使用程序Blast寻找与其最大同源性的的序列。如果测序菌株与标准菌株间的16SrRNA基因同源性值在97.5%以上，一般就可判定它们属于同一个种[9]。

4 抗生素抗性的检测

乳酸菌在MRS固体培养基中,30℃活化，接种到液体MRS培养基中。将培养好的乳酸菌菌液用生理盐水稀释50倍加入灭菌试管中。根据各种药品在全价料中的常规添加量计算所需药品量，精确称取后，无菌操作溶解于溶液中即为浓度C0的药液，同时使用0.5C0和2C0作为对照。以不添加抗生素的试管作为空白对照。在37℃条件下反应4 h后，用MRS琼脂平板计菌数。实验结果用添加抗生素的实验组与不加抗生素的对照组的存活比率表示[4]。

5 结果与分析

5.1 裸鲤肠道样品中微生物的多样性

青海湖裸鲤肠道样品中微生物的分布情况如表2所示。表2中，除样品F5，F16，F17以及F20外；其余样品中都检测到乳酸菌的存在，其数量范围为103～108g-1，在上述样品中，都能检测到存在大量的大肠杆菌和好氧性细菌，其中大肠杆菌数量为103～107g-1，好氧性细菌数量为103～105g-1。部分样品中存在少量的芽孢杆菌。由表2可以看出，只有F4和F10中检测到酵母菌和霉菌，且数量较少，所有样品中均未检出梭菌。

5.2 裸鲤肠道乳酸菌代表株生理生化特性分析

对分离自裸鲤肠道样品的11株乳酸菌进行生理生化特征鉴定，结果显示它们经过革兰氏染色后呈现阳性，而在过氧化氢酶试验中显示阴性。由表中数据可知，只有F7-13和F9-12这两株乳酸菌发酵葡萄糖产CO2，属于异型发酵型乳酸菌；另外9株乳酸菌发酵葡萄糖不产CO2，属于同型发酵型乳酸菌。上述11株乳酸菌均能在3.0%和6.5%的盐浓度下良好生长。F2-2，M 1-5，F9-10和F3-29这几株乳酸菌能在pH值为3.0的酸性环境中生长，具有较强的耐酸性，只有F2-2和F3-29这两株乳酸菌能在p H 10.0的环境中生长良好，具有较强的耐碱性，而其他菌株的生长就比较微弱。由此可见，F2-2和F3-29这两株乳酸菌具有极强的酸碱耐受性，说明这两株菌株的pH生长范围极其广，具有良好的耐酸耐碱性。

表2 青海湖裸鲤中微生物的分布情况

5.3 裸鲤肠道乳杆菌代表株系统进化树的构建

对裸鲤肠道样品中所分离的11株乳杆菌代表菌株进行16S rRNA基因序列分析，用邻接法(Neighbor-joining)构建系统进化树如图1所示。结合乳酸菌菌株16SrRNA基因序列在DDBJ网站上的Blast比对结果和系统进化树，经鉴定 M 7-13，M 1-8，F2-3，F7-13，F4-15，M 1-6为Lactobacillussake（54.5%）；F16-85为Lactobacillusfuchuensis（9.1%）；F2-2，F9-12，F3-29为Lactobacilluscasei（36.4%）。经研究发现裸鲤肠道富含多种乳杆菌，Lactobacillussake是裸鲤肠道常见杆菌类，这与崔美岩等人[8]的研究结果一致。除此之外，本研究发现Lactobacilluscasei也是裸鲤肠道乳杆菌的主要种类。

5.4 抗生素耐药性分析

根据表4中数据可知，所检测的8株菌株对 VA，GM，PB，CIP，PG，TE均耐药。除F16-85菌株对所用10种抗生素均耐药外，观察可知，其余7株菌株对氯霉素（CHL）、红霉素（ERY）敏感或中度敏感。而对于利福平（RA）、氨苄林（AM）两种抗生素，所测菌株表现出不同的药敏性，如F4-15和F16-85对这两种抗生素耐药，而其他5株菌株对其敏感或中度敏感。

6 结论

结果表明，青海湖裸鲤肠道内含有微生物种类丰富，存在大量的大肠杆菌和好氧性细菌，均未检出梭菌。除样品F5，F16，F17以及F20外，其余样品中都检测到乳酸菌的存在。通过对其生理生化特性的研究，检测出F2-2和F3-29这两株乳酸菌的pH生长范围极广，表明其具有良好的耐酸耐碱性。在对其抗生素益生性的分析中，观察到F16-85耐药性极好，对所用的抗生素均耐药，耐药性最差的为F7-13，只对万古霉素、庆大霉素、多粘菌素和环丙沙星这四种抗生素耐药。

表3 11株代表株的生理生化特性的检测结果

表4 乳酸菌抗生素耐药性检测

图1 裸鲤肠道样品中乳酸杆菌系统进化树