超高效液相色谱-串联质谱法测定血液中的痕量普罗帕酮

刘慧许小龙袁博

1.昆山海关 江苏昆山 215300；2.江苏中谱检测有限公司

普罗帕酮又名心律平，是临床上最广泛使用的抗心律失常药物之一[1]，可用于预防和治疗室性和室上性异位搏动、室性或室上性心动过速、预激综合征、电复律后室颤发作等，起效快，作用持久[2]。然而，该药血药浓度与剂量呈非线性关系，且个体差异较大，剂量增加3倍血药浓度可增加10倍，增量时应特别谨慎，最好能监测血药浓度，如过量使用可能导致中毒甚至死亡[3]。因此，准确检测血液中普罗帕酮的浓度对于临床诊断与治疗有着重大意义。

目前，文献中报道的滴定法[4]、电化学法[5-6]、分光光度法[7]、荧光光谱法[8]等在盐酸普罗帕酮原药、片剂及注射液等基质较为简单的样品检测中应用较多；而对于血液样品的测定，由于其基质复杂，干扰物多，测定前需要将样品中的普罗帕酮与其他干扰物分离，因此测定血液中普罗帕酮的浓度，较多的采用色谱法及色谱质谱联用法。传统的液相色谱法[9-11]一般采用紫外检测器，根据吸光度定量，该方法技术成熟、通用性好、灵敏度高，在普罗帕酮的测定中有一定应用，但在定性能力上稍差一些；由于质谱可以提供部分结构信息，在定性方面有一定的优势，因此，采用液相色谱-质谱法[2]测定血液中普罗帕酮的浓度，抗干扰能力明显优于传统的液相色谱法。然而，单级质谱一般只能提供分子量，多级质谱能提供更多的结构信息以辨别假阳性数据，采用多级质谱能更有效地去除基质的干扰，保证痕量物质分析的准确性。本研究直接对基质复杂的血液样品进行提取，通过对样品提取、质谱条件等进行优化，建立了一种超高效液相色谱-串联质谱法测定血液样品中痕量普罗帕酮浓度的简便方法。该方法取样量少，适合血液样品的取样特殊性；准确性好，能有效去除血液样品基质的干扰；灵敏度高，可准确测定痕量普罗帕酮的浓度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪、TSQ Quantum MS三重四级杆质谱仪 （赛默飞世尔科技（中国）有限公司），配加热电喷雾离子源（HESIⅡ）；高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）；MVM-200多管漩涡混合仪（深圳祥申科技有限公司）；普罗帕酮粉末标准品（CAS：54063-53-5，纯度 99.5%，德国Sigma）；甲醇、甲酸（色谱纯，美国天地有限公司）；采用兔血加标模拟血液样品。

普罗帕酮标准工作溶液：称取普罗帕酮10 mg于100 mL容量瓶中，加入含90%（体积分数，下同）甲醇的水溶液完全溶解后定容至刻度，充分混合即得普罗帕酮标准储备液A；移取1 ml标准储备液A于100 mL量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合即得普罗帕酮标准储备液B；移取1 mL标准储备液B于100 mL量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合即得普罗帕酮标准储备液C；分别移取 0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mL 标准储备液 C至5个10 mL容量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合得一组普罗帕酮质量浓度分别为100、200、500、1 000、2 000 pg/mL 的标准工作溶液，移取2.3 mL浓度为100 pg/mL的标准工作溶液至10 mL容量瓶中，用90%甲醇水溶液定容至刻度，充分混合得普罗帕酮浓度为23 pg/mL的标准工作溶液。

1.2 色谱质谱条件

色谱柱：Phenomenex C18 （4.6 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为含0.1%（质量分数，下同）甲酸水溶液，梯度洗脱条件：0～1 min：10%～50%A；1～2 min：50%A；2～3 min：50%～96%A；3～6 min：96%A；6～6.01 min：96%～100%A；6.01～7 min：100%A；流速 0.6 mL/min，进样量 10 μL，柱温 25℃。

质谱条件：HESIⅡ；正离子扫描模式；质谱扫描模式为选择离子反应监测（SRM）；喷雾电压2.5 kV；毛细管温度 350℃，离子源温度 400℃，鞘气（N2）流速 4 Arb（热电专用单位），辅助气（N2）流速 10 Arb。优化碰撞能量，根据离子信号强弱选择定性离子和定量离子，详细参数见表1，普罗帕酮标准溶液质谱图见图1。

表1 普罗帕酮的质谱主要参数

图1 普罗帕酮标准工作溶液的质谱图

1.3 试验方法

取血液样品50 μL，加入100 μL水，涡旋混匀1 min；加入甲醇定容至1 mL，自动涡旋仪2 500 rpm涡旋10 min；离心1 500 rpm，4 min；取上清液过0.45 μm尼龙滤膜；进样分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

2.2.1 提取溶剂

将目标化合物从样品中提取出来是检测的首要步骤，提取溶剂的提取效率会直接影响检测结果。配制浓度为500 pg/mL的普罗帕酮样品溶液，试验考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙醚等几种常用溶剂对该样品溶液的提取效率，结果见图2。从图2可以看出，4种提取溶剂中，甲醇和乙腈对血液中普罗帕酮的提取效果较好。考虑到乙腈毒性较甲醇大，价格也相对较高，从经济环保的角度出发，实际检测选择甲醇较为合适。

图2不同提取溶剂对血液中普罗帕酮提取效率的影响

2.2.2 提取时间

试验考察了提取时间分别为1、3、5、10 min时，提取率与提取时间的关系，结果见图3。由图3可知，提取时间从1 min增加至10 min，提取率并无明显变化，说明提取剂对普罗帕酮的提取速率较快，1 min内已达到平衡。因此，试验选择提取时间为1 min，这也缩短了样品前处理时间。

图3 提取时间对血液中普罗帕酮提取效率的影响

2.2 流动相的选择

试验考察了纯水和质量分数为0.1%、0.2%、0.5%的甲酸水溶液作水相流动相，甲醇作有机相时，对普罗帕酮色谱峰的影响。结果表明，几种不同的水相流动相对峰形影响不大，但峰面积有一定差异，具体见图4。从图4可以看出，0.1%甲酸水溶液作为水相流动相时峰面积比纯水作为流动相大，可能是由于甲酸的加入提高了离子化效率；随后，甲酸浓度增加至0.2%及0.5%，峰面积却随之下降，可能是由于甲酸浓度高了竞争电荷能力变强导致信号下降。因此，试验采用质量分数为0.1%的甲酸水溶液作为水相流动相。

图4流动相中甲酸溶液的浓度对普罗帕酮色谱峰的影响

2.3 标准曲线及测定下限

以10倍信噪比估算，得到普罗帕酮的测定下限460pg/mL。按仪器工作条件测定浓度为23、100、200、500、1 000、2 000 pg/mL的普罗帕酮标准工作溶液，以质量浓度对峰面积作校准曲线。结果表明：普罗帕酮的质量浓度在23～2 000 pg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，线性回归方程为：y=107.6x+423.1，相关系数为0.9996。

2.4 精密度和回收率试验

取3个血液样品按试验方法进行精密度和回收率试验，平行测定6次，结果见表3，加标回收率在95.79%～98.11%之间，相对标准偏差在0.89%～2.4%之间，表明该检测方法具有较高的准确度和精密度。

表3 精密度和回收试验结果（n=6）

3 结论

本工研究采用超高效液相色谱-串联质谱法测定血液样品中的痕量普罗帕酮，该方法可直接针对基质复杂的血液样品进行，取样量少、样品前处理简单快速、干扰少、测定下限低、测定结果准确可靠，可广泛应用于临床检验。