窖蛋白-1在小鼠不同发育时期成釉细胞中的免疫电镜观察

史 璐，白书锋，李凌云，冯海玲

郑州大学第一附属医院牙体牙髓科 郑州 450052

胞膜窖(Caveolae)是细胞膜上特异性内陷微区，直径50～100 nm，主要由胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和窖蛋白(Caveolin)组成，其中前三者构成Caveolae的脂质核心，形成一个不溶于去垢剂的膜区域[1]。Caveolin是Caveolae的表面标记蛋白，相对分子质量为21 000～25 000，分为1、2、3三型，其中Caveolin-1是Caveolae最重要的表面功能蛋白。Caveolin-1自身形成同源多聚体，或与Caveolin-2结合形成异源多聚体，多表达在内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞中[2]；Caveolin-3主要分布于骨骼肌、心肌和平滑肌，在星形胶质细胞和软骨细胞也有表达[1]。Caveolae和Caveolin在细胞生物学功能中起着关键作用，包括细胞的胞吞胞饮、胆固醇和脂质平衡、细胞信号转导等[1]。作者所在的课题组[3]对不同发育阶段小鼠下颌第一磨牙牙胚中Caveolin-1的表达进行了免疫组化研究，发现在不同时期的牙胚上皮细胞中均有Caveolin-1表达，提示其可能在牙齿发育过程中发挥作用。Caveolae通常呈瓶颈状，也可呈平铺状、管状或形成分离的小泡进而融合成直径大于100 nm的结构。Caveolae的形状取决于细胞的生理状况，如Caveolae耗尽胆固醇时呈扁平状[4]。不同发育阶段成釉细胞中Caveolae/Caveolin-1的形态、超微结构定位仍不清楚。本实验拟采用透射电镜及免疫电镜观察小鼠牙胚发育过程中成釉细胞Caveolae结构，为深入研究Caveolae和Caveolin-1在牙胚发育及成釉细胞生物学功能中的作用提供组织学参考。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器兔抗小鼠Caveolin-1单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；10 nm胶体金标记羊抗鼠二抗、饱和苦味酸购自Sigma-Aldrich公司。LR White树脂套装、200网孔镀膜镍网、戊二醛、醋酸双氧铀、柠檬酸铅均购自北京中兴百瑞科技有限公司。锇酸购自上海劲马生物科技有限公司。全自动组织脱水机、组织包埋机、组织切片机、摊片烤片机、显微镜病理成像系统、UC6型超薄切片机均购自德国Leica公司。日本日立H-7650型透射电子显微镜。

1.2标本来源交配6～8周龄、体健的C57BL/6小鼠由山东大学实验动物中心提供，胎龄计算以小鼠交配见到阴道栓后的中午定为胚胎发育第0.5天，新生小鼠出生当天中午定为出生第0.0天。取胚胎发育第16.5天和第18.5天以及出生第2.0天的新生鼠下颌第一磨牙牙胚用于本实验研究。每个时期取3个样本。胎鼠牙胚取出后立即置于4 ℃、30 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定12 h备用。出生第2.0天的牙胚固定后，经EDTA脱钙7 d备用。

1.3牙胚HE染色上述标本经常规石蜡包埋后，5 μm 厚连续冠状切片，HE染色，中性树胶封片。光学显微镜下观察并拍照。

1.4成釉细胞超微结构观察将标本置于体积分数1%锇酸中室温固定2 h，乙醇和丙酮联合梯度脱水，环氧树脂812包埋，制备70 nm超薄切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，于透射电镜观察成釉细胞超微结构并拍照。

1.5成釉细胞中Caveolin-1的免疫电镜定位标记采用包埋后胶体金染色技术。①样品制备：将标本置于固定剂中冰上固定4 h(固定剂配方：40 g/L多聚甲醛+体积分数0.1%戊二醛+体积分数0.06%苦味酸+0.1 mol/L二甲砷酸钠，pH=7.4)。PBS缓冲液(0.1 mol/L， pH=7.4)冰上漂洗4次×15 min/次；逐级乙醇4 ℃脱水。体积分数100%乙醇-LR White置换及纯LR White浸透过夜，最后包埋于0.5 mL 离心管中，室温下放置3 h，50 ℃聚合3 h，再置于常温环境中以保证LR White凝固。制备70 nm超薄切片，收集在200网孔的镀膜镍网上。②免疫染色：超薄切片以体积分数10%正常羊血清封闭1 h后加入一抗(按1∶1 000稀释)室温作用2 h；PBS缓冲液洗涤3次×1 min/次，阴性对照片不加一抗；加入1∶40稀释的胶体金标记的羊抗鼠二抗，室温下孵育2 h；PBS缓冲液洗涤3次×1 min/次。最后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染后，透射电镜观察并拍照。金标蛋白结合处可见黑褐色颗粒。

2 结果

2.1不同发育时期小鼠成釉细胞HE染色及超微结构观察结果见图1、2。胚胎发育第16.5天(帽状期)，成釉器呈帽状，内釉上皮呈矮柱状，单层排列；电镜下内釉上皮细胞中可见粗面内质网、线粒体、细胞连接等细胞器，细胞膜上可见烧瓶状凹陷结构。胚胎发育第18.5天(钟状期)，成釉器进一步分化，内釉细胞分化为前成釉细胞，呈立方状；电镜下细胞膜表面亦可见烧瓶状凹陷结构。出生第2.0天(钟状晚期)，成釉细胞发育成熟，呈高柱状，细胞核极性倒置，远离基底膜，成釉细胞开始分泌釉基质；电镜下成釉细胞中可见大量粗面内质网，管腔较大，细胞质内有大量形状不一大小不等的囊泡、分泌颗粒和纤维样成分，说明成釉细胞已分化成熟，具有分泌功能，同时细胞膜上亦可见烧瓶状凹陷性结构。

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A:×200; C、E:×100; B、D、F:×400。iee：内釉上皮; oee：外釉上皮; sr：星网状层; si：中间层; dp：牙乳头; ab：成釉细胞; ob：成牙本质细胞

图1不同发育时期小鼠下颌第一磨牙牙胚HE染色结果

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A、C、E:×10 000；B、D、F:×30 000。细胞膜表面烧瓶状凹陷性结构如箭头所示并局部放大；rer：粗面内质网；m：线粒体；n：细胞核；j:细胞连接；g：高尔基复合体；sg:分泌颗粒；f：纤维样成分；v：囊泡

图2不同发育时期小鼠成釉细胞超微结构透射电镜观察结果

2.2不同发育时期小鼠成釉细胞中Caveolin-1的定位观察结果见图3。从小鼠胚胎第16.5天的牙胚上皮细胞至小鼠出生第2.0天的成釉细胞中均可见到Caveolin-1免疫阳性颗粒沉积，主要定位于细胞膜及细胞质内。小鼠出生第2.0天成熟成釉细胞中的粗面内质网腔内也发现有免疫阳性颗粒沉积。

A：胚胎第16.5天；B：胚胎第18.5天；C：出生第2.0天。箭头所示为免疫阳性颗粒；rer：粗面内质网；n：细胞核图3 不同发育时期小鼠成釉细胞中Caveolin-1免疫电镜观察结果(SP，×40 000)

3 讨论

本实验首先利用HE染色和透射电镜观察了不同发育阶段成釉细胞的组织学和超微结构，发现随着成釉细胞的分化，细胞的形态及超微结构都发生了显著变化：细胞形态从矮立方状变为高柱状；细胞核远离基底膜，极性倒置；细胞器数量逐渐增多，粗面内质网和高尔基复合体数目增加，胞质中出现大小不等的分泌颗粒，意味着成釉细胞从未分化状态逐渐分化为成熟的、具有分泌功能的细胞。这些与其他学者[5-6]的研究结果一致。

免疫电镜观察可见，成釉细胞细胞膜表面有Caveolin-1免疫胶体金颗粒沉积，说明在成釉细胞的细胞膜表面存在Caveolae结构。Caveolae和Caveolin在多种细胞生物学功能中起到关键作用，特别是与细胞信号转导、胞吞胞饮、胆固醇转运、血管生成等密切相关。许多信号分子均聚集在Caveolae区，Caveolae被认为是细胞信号转导平台， Caveolin-1处于该平台中各个信号通路的中心位置。在牙胚发育过程中，Caveolin-1 mRNA在胚胎第9.5天第一鳃弓间充质细胞中及胚胎第16.5天下颌第一磨牙牙胚细胞中均有表达，且表达水平增加[7]。研究[3]发现，自牙胚发育的第13.5天，牙胚上皮中即可检测到Caveolin-1的表达；随着牙胚的发育，Caveolin-1始终表达于内釉上皮细胞和成釉细胞中，且Caveolin-1 mRNA表达水平逐渐升高，在出生第2.0天增加最为显著。在体外培养的成釉细胞中，封闭Caveolin-1基因可降低高糖型细胞外基质金属蛋白酶诱导物和基质金属蛋白酶-2的表达[8]。这些研究结果表明Caveolin-1参与了牙胚发育和成釉细胞的生物学活动。

本实验在成熟成釉细胞的内质网腔中也观察到了Caveolin-1免疫胶体金颗粒沉积。有研究[9]认为Caveolin-1是在内质网中合成组装完成的。此外，根据钙释放激活钙通道(calcium release-activated calcium channel, CRAC)理论，CRAC是非兴奋性细胞钙离子内流的主要通道，它的开启是由钙库耗竭所激发的，内质网则是细胞内钙离子储库。研究[10]表明：CRAC可能是釉质成熟过程中成釉细胞钙摄入的关键性机制，相关成员的基因突变可导致釉质发育缺陷。第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)与内质网上的IP3受体结合导致内质网钙离子短暂而迅速的释放，内质网钙浓度的下降激活了位于胞膜的CRAC通道, 导致细胞外钙通过胞膜持续流入，Caveolae被认为是IP3释放的位点[11]。同时，有学者[11]认为Caveolin-1可能通过3种途径调节细胞质钙离子流的形成，其中，携带有钙离子的Caveolae囊泡可能通过鞘糖脂肌醇锚定受体参与的细胞内吞作用将钙离子运输至邻近的内质网。并且有研究[11]发现细胞质中有些内质网富集于富含Caveolin-1的细胞膜区域，这样Caveolae囊泡不必迁移过远即可将大量的钙离子运输至这些内质网。本研究中观察到的内质网腔中有Caveolin-1免疫胶体金颗粒沉积的现象能否成为支持上述理论和假说的组织学证据还需要进一步的验证。但可以肯定的是：牙釉质是高度矿化的组织，健康牙釉质的形成依赖于稳定的钙离子供给。釉质形成过程中，成釉细胞发挥着上皮性半透膜的功能转运钙离子。成釉细胞既要操控大量钙离子的转运，同时还要避免过量钙离子的毒性作用[12]。成釉细胞必须精确调节、缓冲钙离子流，控制细胞器中钙离子的储存、释放和排出。Caveolae/Caveolin-1在细胞钙离子转运中发挥了重要作用，因此有必要对Caveolae/Caveolin-1在成釉细胞钙离子转运中的作用进行深入研究。