CPEB4对脑胶质瘤细胞增殖、迁移的影响

张成刚

济南市第三人民医院神经外科 济南 250132

脑胶质瘤是一种常发于成人中枢神经系统的恶性肿瘤，主要由神经外胚层衍生形成，约占成人颅内恶性肿瘤的49.7%[1]。目前对脑胶质瘤的治疗仍以手术切除为主，术后辅以放、化疗，但由于脑胶质瘤具有侵袭性高的特点，手术不能彻底切除癌变组织，术后复发率极高，生存率较低[2-3]。脑胶质瘤的发生、发展与某些基因的表达异常有关[4]，探索新的治疗靶点对治疗具有重要意义。胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白4(cytolasmic polydenylation element-binding protein 4,CPEB4)是一类能与RNA特异性结合的蛋白[5]，其在胰腺癌[6]及脑胶质瘤[7]中具有较高的表达，可调控肿瘤细胞的恶性生长、侵袭迁移、凋亡及血管生成等[8]，但是相关作用机制还不清楚。本研究通过实时荧光定量PCR检测人脑胶质瘤组织中CPEB4的表达,并观察用siRNA沉默CPEB4基因以及用JAK2/STAT3信号抑制剂AG490下调CPEB4表达对脑胶质瘤细胞U87增殖、迁移能力的影响，以期为靶向CPEB4治疗人脑胶质瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1脑胶质瘤组织中CPEB4的表达

1.1.1 组织来源 收集2012年7月至2017年6月在济南市第三人民医院及山东省千佛山医院手术切除的新鲜脑胶质瘤组织及相应的癌旁正常组织40例，均经病理证实。患者男28例，女12例，中位年龄48.2岁。

1.1.2 组织中CPEB4 mRNA的检测 每例样本取50 mg组织，剪碎后加入1 mL Trizol(美国 Invitrogen公司)进行匀浆，将匀浆液转移至离心管中，混匀后于室温静置5 min，加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s，4 ℃12 000 r/min离心15 min，将上清转移至新的离心管中并加入等体积预冷的异丙醇，混匀后置于冰上10 min，离心取沉淀，体积分数75%乙醇洗涤2次，晾干后用20 μL DEPC水溶解沉淀，微量核酸仪检测RNA浓度。利用PrimerScriptTM反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)说明操作。引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法计算CPEB4 mRNA的相对表达量。CPEB4上游引物序列：5’-TGGGGATCAGCCTCTTCATA-3’,下游引物序列：5’-CAATCCGCCTACAAACACCT-3’。内参GAPDH上游引物序列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，下游引物序列：5’- AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.2沉默CPEB4基因后U87细胞增殖和迁移能力的变化

1.2.1 细胞培养 脑胶质瘤U87细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中常规传代培养。

1.2.2 实验分组 实验分3组，对照组、无义siRNA组及CPEB4 siRNA组。以5×105mL-1将U87细胞接种于6孔板，待细胞融合度达到75%时，无义siRNA组及CPEB4 siRNA组参照Lipofectamine2000转染试剂盒(美国 Invitrogen公司)说明操作，分别转染无义siRNA和CPEB4 siRNA；对照组不转染。每组设置6个复孔。CPEB4 siRNA及无义siRNA均由上海吉玛公司设计并合成，正义链序列分别为5’-GCAAAGCAATACTGGGAAT-3’和5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。实验均重复3次。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 取处于对数生长期的3组细胞，置于37 ℃恒温细胞培养箱中培养48 h，向细胞中加入5 g/L MTT(上海华美生物工程公司)10 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清，加100 μL DMSO溶液振荡培养至结晶物完全融化，酶标仪检测490 nm处吸光度(A)，计算细胞存活率。细胞存活率=实验组A/对照A。

1.2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取处于对数生长期的3组细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化后，离心取沉淀，用新鲜细胞培养基重悬后接种至24孔板，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养过夜。使用移液枪枪头在贴壁细胞中小心划一条细痕，PBS洗涤后加入细胞培养液，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中继续培养48 h。倒置显微镜下观察，血细胞计数仪中心计数线边缘为1/4 mm，边缘计数线最小长方形长为(1/4×5) mm。分别于培养0、48 h时于400倍显微镜下测定20个细胞向划痕中心移动的距离，即为迁移距离。

1.2.5 Western blot法检测细胞中不同蛋白的表达转染48 h后，收集3组细胞，裂解，利用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg蛋白与Loading buffer充分混合，100 ℃煮沸5 min制备上样蛋白。将上样蛋白完全加入到SDS-PAGE上样孔中进行电泳，电压80 V电泳30 min后，调整电压为120 V继续电泳直至结束。取出蛋白胶，4 ℃条件下将蛋白转印至PVDF膜，用50 g/L脱脂奶粉封闭3 h，依次加入抗CPEB4、MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2一抗(抗体均来源于美国Abcaminc公司，稀释度均为1∶500)，加二抗(稀释度为1∶1 000)，然后ECL发光剂显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。以目的蛋白与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.3抑制JAK/STAT3信号通路后U87细胞增殖及迁移能力的变化实验分为3组，对照组、AG490(美国Sigma公司)组与AG490+CPEB4 siRNA组。对照组为不经任何处理的U87细胞，AG490组用50 μmol/L的AG490处理U87细胞48 h，AG490+CPEB4 siRNA组用50 μmol/L的AG490处理转染CPEB4 siRNA的U87细胞48 h。每组设置5个复孔，实验重复3次。细胞增殖和迁移能力的检测方法同1.2.3和1.2.4,实验重复3次。

1.4统计学处理使用SPSS 21.0处理数据。脑胶质瘤和相应癌旁正常组织中CPEB4 mRNA表达水平的比较采用配对t检验；3组细胞间CPEB4、MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2蛋白表达水平、细胞存活率和迁移距离的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CPEB4mRNA在脑胶质瘤组织中的表达与癌旁正常组织中相对表达量(0.964±0.074)相比，脑胶质瘤组织中CPEB4 mRNA的相对表达量(3.664±0.321)显著升高(t配对=14.196，P<0.001)。

2.2沉默CPEB4基因对U87细胞增殖和迁移能力的影响

2.2.1 3组细胞中CPEB4蛋白表达水平的比较结果见图1、表1，对照组及无义iRNA组CPEB4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，CPEB4 siRNA组CPEB4蛋白表达水平较2个对照组降低(P<0.05)。

2.2.2 3组细胞增殖及迁移能力的比较 3组细胞存活率及迁移距离测定结果见表1。对照组与无义RNA组细胞存活率及迁移距离差异无统计学意义(P>0.05)，CPEB4 siRNA组细胞存活率及迁移距离较2个对照组降低(P<0.05)。

2.2.3 3组细胞中MMP-9、MMP-2、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2蛋白表达水平的比较 见图2、表2。对照组与无义siRNA组这6种蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，CPEB4 siRNA组这6种蛋白的表达水平均较2个对照组降低(P<0.05)。

1：对照组；2：无义RNA组；3：CPEB4 siRNA组

图1 3组U87细胞中CPEB4蛋白的表达表1 3组细胞中CPEB4蛋白表达水平、细胞存活率及迁移距离的比较

*：与其他2组相比，P<0.05

1：对照组；2：无义siRNA组；3：CPEB4 siRNA组图2 3组细胞中JAK/STAT3通路蛋白的表达表2 3组细胞中JAK/STAT3通路蛋白表达的比较

组别nMMP-9 MMP-2 STAT3 p-STAT3 JAK2 p-JAK2对照组 3 0.426±0.038 0.302±0.028 0.324±0.032 0.138±0.015 0.387±0.042 0.177±0.020无义siRNA组 3 0.454±0.041 0.296±0.026 0.331±0.034 0.140±0.016 0.366±0.040 0.189±0.021CPEB4 siRNA组 3 0.157±0.018* 0.141±0.015* 0.132±0.014* 0.036±0.006* 0.145±0.017* 0.042±0.007*F 70.174 44.494 48.304 61.578 44.284 67.379P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

*：与其他2组相比，P<0.05

2.3抑制JAK/STAT3信号通路对U87细胞增殖及迁移能力的影响结果见表3。与对照组相比，AG490组与AG490+CPEB4 siRNA组细胞存活率和迁移距离均降低(P<0.01)；与AG490组相比，AG490+CPEB4 siRNA组细胞存活率与迁移距离更低(P<0.05)。

表3 3组细胞存活率与迁移能力的比较

*：与对照组相比，P<0.05；#：与AG490组相比，P<0.05

3 讨论

脑胶质瘤是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，由于具有浸润性生长的特点，手术难以完全切除，术后复发率高，生存期仅为6～12个月。随着基因工程的发展，人们逐渐开始从分子生物学的角度探求胶质瘤的发病机制，并希望从基因水平寻找到治疗的方法。

CPEB4基因位于人类染色体的5q21，含有一个RNA识别序列及一个锌指结构，长度为7 769 bp[9]，表达后定位于细胞质。有研究[10]认为，CPEB4是一种神经细胞存活蛋白，在肿瘤发展过程中，对基因转录后调节具有重要作用，可以促进肿瘤的生长、血管的生成及侵袭的发生。已有报道CPEB4在皮肤癌[11]、结直肠癌[12]及肝癌[13]中过表达。本研究发现CPEB4在脑胶质瘤组织中的表达较癌旁正常组织显著升高。

本研究发现，利用RNAi技术抑制脑胶质瘤U87细胞中CPEB4的表达后，U87细胞的增殖和迁移能力降低。MMP-2是锌离子依赖蛋白水解酶，由肿瘤细胞和间质细胞分泌，激活后能特异降解基底膜Ⅳ型胶原，改建细胞外基质，继而促进肿瘤新生血管形成，促进肿瘤的迁移与侵袭[14]。MMP-9以酶原的形式分泌，活化后形成Ⅳ型胶原酶，破坏肿瘤表面细胞外基质中的Ⅳ型胶原等，促进肿瘤细胞向周围组织浸润性生长，导致肿瘤的侵袭及转移[15]。本研究结果显示，抑制CPEB4表达后U87细胞中MMP-2和MMP-9表达水平下降，说明CPEB4可能通过调节MMP-2和MMP-9的表达影响脑胶质瘤细胞的迁移。

JAK/STAT3信号通路广泛存在于真核生物中，由多种细胞因子及生长因子参与，在调控细胞增殖、分化、免疫等过程中发挥重要作用[16]。外界刺激可能使细胞因子或生长因子与细胞膜上相应受体结合，活化JAKs，激活胞质中的STATs，活化后的STATs进入细胞核与靶基因结合，启动下游基因表达[17]。研究[18]表明JAK/STAT信号通路参与了脑部发育，在神经细胞分化、再生等方面具有重要作用。STAT3被报道参与脑胶质瘤的增殖、迁移、凋亡等过程[19]。AG490是JAK2特异性拮抗剂，能特异性阻断JAK/STAT3信号通路。本研究结果显示,利用siRNA抑制CPEB4表达后U87细胞中JAK2及STAT3表达下调；AG490可降低U87细胞的增殖与迁移能力，与CPEB4 siRNA作用方向一致；AG490+CPEB4 siRNA组细胞增殖与迁移能力较AG490组更低。说明CPEB4促进U87细胞的增殖与迁移与上调JAK/STAT3信号通路有关。

综上所述，CPEB4在脑胶质瘤组织中表达上调，能够促进脑胶质瘤细胞的增殖和迁移，其作用机制可能与JAK/STAT3信号通路有关。本研究结果为进一步研究CPEB4在脑胶质瘤发病中的作用奠定了基础，为临床靶向治疗提供了理论依据。