miRNA-223-3p调控JAK2/STAT3信号通路对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响

谢 琼，胡桂明，王洪涛

1)郑州市妇幼保健院超声科 郑州 450012 2)郑州大学第二附属医院病理科 郑州 450014 3)郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有早期易转移、晚期难治疗、预后差等特点[1]。据统计[2]，我国胃癌的病死率呈整体上升趋势。针对目前的形势，寻找治疗的方法及肿瘤标志物进行早期诊断是解决问题的关键。miRNA是一类长度为20～25个核苷酸的小分子非编码RNA，其可通过与靶基因结合使靶基因的转录和翻译受到抑制而发挥生物学作用[3]。有研究[4-5]显示，miRNA参与细胞的增殖、凋亡等过程，在胃癌等多种肿瘤细胞中表达异常。 miRNA-223-3p在胃癌组织及MKN-28细胞高表达，参与胃癌的发生，但具体机制尚不完全清楚[6]。JAK/STAT信号通路参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生命活动过程，JAK2作为上游激酶活化后募集胞浆中的STAT3单体，使无活性的STAT3形成有活性的二聚体，转移到细胞核与DNA集合，从而导致靶基因的开启[6-8]。近些年来发现JAK2/STAT3的激活参与了肿瘤的发生及发展[9]。鉴于此，本研究观察了miRNA-223-3p是否可调节JAK2/STAT3信号通路影响胃癌的发生及转移，以期为今后研究及临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 组织和细胞 40份胃癌组织及相应的癌旁组织为郑州大学第二附属医院手术切除冻存标本，其中男26例，女14例，中位年龄56岁。人胃癌细胞株MKN-28由郑州大学生命科学学院提供。

1.1.2 试剂和仪器 FBS、胰蛋白酶、青链霉素、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司；CCK8细胞增殖试剂盒购自北京庄盟有限公司；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国BD公司；Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国Abcam公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司；细胞培养箱购自美国西盟公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2细胞培养取保存于液氮罐中的胃癌细胞株MKN-28，37 ℃水浴锅快速解冻后，将细胞转移到一个新的离心管中，加入含有体积分数10% FBS、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640细胞培养基，1 000 r/min离心5 min，去除上清，加入细胞培养液悬浮细胞，并接种于细胞培养板，置于温度37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。细胞贴壁后换液一次，之后每2～3 d换液一次，细胞融合度达到80%～90%时进行传代。

1.3胃癌和癌旁组织中miRNA-223-3p表达的RT-PCR检测Trizol法提取40份胃癌组织和癌旁组织中的总RNA，以紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量。根据反转录试剂盒说明将RNA反转录成cDNA，按照PCR试剂盒操作说明进行目的基因的扩增。以U6作为内参，按照2-ΔΔCt的方法进行计算。实验重复3次，结果取平均值。

1.4MKN-28细胞miRNA-223-3p表达水平的RT-PCR检测实验分为两组：miRNA-223-3p对照组(转染miRNA-223-3p对照)和miRNA-223-3p抑制组(转染miRNA-223-3p抑制物)。取对数生长期的人胃癌细胞株MKN-28，2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，观察到细胞消化完全后将细胞转移到一个新的离心管中，1 000 r/min离心10 min，将上清去除，加入不含FBS的培养液，在细胞培养板中接种，置于温度37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行1 h培养。将miRNA-223-3p对照或miRNA-223-3p抑制物与培养液摇匀后加到胃癌细胞株MKN-28中，置于温度37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行6 h培养后，换到含有FBS的完全培养基进行培养。RT-PCR检测2组细胞中 miRNA-223-3p的表达水平。

1.5MKN-28细胞增殖检测取miRNA-223-3p对照组和miRNA-223-3p抑制组胃癌细胞，用细胞培养液悬浮细胞，将细胞密度调整为4×105mL-1，并接种于96孔细胞培养板中，每组设置5个复孔，每孔加入细胞悬液100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中分别培养24、48及72 h后，加入CCK8溶液10 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱孵育4 h，在波长为450 nm处采用酶标仪进行测定并记录其吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6MKN-28细胞凋亡率检测miRNA-223-3p对照组和miRNA-223-3p抑制组胃癌细胞转染48 h后，以1×106mL-1接种于96孔细胞培养板中，取1 mL细胞悬液放于离心管，4 ℃1 000 r/min离心7 min，去除上清，经过两次洗涤后，加入Binding Buffer 200 μL摇匀，之后分别加入PI、Annexin-V，保持室温，避光放置20 min，加入Binding Buffer 400 μL，采用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测。实验重复3次。

1.7MKN-28细胞迁移数检测将转染48 h的miRNA-223-3p对照组和miRNA-223-3p抑制组细胞密度调整为105mL-1，在Transwell小室下层加入含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基500 μL，其上层加入细胞悬液100 μL，培养24 h后，去除上下室培养基，上层分别加入上述两组细胞，下层加入含体积分数10% FBS的培养基，不同浓度均设置3个复孔，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养48 h后，去除培养基，用棉签将膜上细胞拭掉， HE染色后显微镜下观察，选5个200倍视野拍照计数。实验重复3次。

1.8MKN-28细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的Westernblot检测取转染48 h的miRNA-223-3p对照组和miRNA-223-3p抑制组胃癌细胞，PBS洗涤细胞，取适量裂解液实施细胞裂解，时间为30 min，之后收集细胞，4 ℃14 000 r/min离心15 min，取上清液。蛋白浓度测定采用BCA试剂盒。将上样缓冲液和蛋白样品融合后，采用SDS-PAGE电泳实施分离，4 ℃转膜过夜。将PVDF膜取出以50 g/L脱脂奶液实施封闭，分别加入一抗(1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL试剂盒显色，显影、定影、照相。采用Quantity One软件检测蛋白条带灰度值，以GADPH为内参，目的蛋白与内参比值作为蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.9统计学处理采用SPSS 20.0进行数据分析。胃癌组织和癌旁组织中miRNA-223-3p表达的比较采用配对资料的t检验；miRNA-223-3p抑制组和miRNA-223-3p对照组miRNA-223-3p相对表达量，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量，细胞凋亡率、迁移数的比较，均采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miRNA-223-3p在胃癌组织中的表达胃癌组织中miRNA-223-3p的表达(3.672±0.468)显著高于癌旁组织(0.956±0.015)(t配对=10.047，P=0.001)。

2.2 2组MKN-28细胞miRNA-223-3p的表达miRNA-223-3p抑制组(0.281±0.062)与miRNA-223-3p对照组(1.000±0.001)比较，miRNA-223-3p表达降低(t=20.086，P<0.001)。

2.3miRNA-223-3p对MKN-28细胞增殖的影响miRNA-223-3p抑制组与miRNA-223-3p对照组相比，细胞增殖受到抑制，见图1。

图1 2组MKN-28细胞生长曲线

2.4miRNA-223-3p对MKN-28细胞凋亡的影响miRNA-223-3p抑制组凋亡率(16.88%±1.23%)与miRNA-223-3p对照组(2.46%±0.56%)比较，细胞凋亡率升高(t=18.481，P<0.001)。

2.5miRNA-223-3p对MKN-28细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达的影响miRNA-223-3p抑制组与miRNA-223-3p对照组相比，Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低。见图2、表1。

图2 miRNA-223-3p对MKN-28细胞中Bax、Bcl-2及Cleaved-Caspase3蛋白表达的影响表1 2组MKN-28细胞中Bax、Bcl-2及Cleaved-Caspase3蛋白表达的比较

组别nCleaved-Caspase3Bcl-2BaxmiRNA-223-3p对照组30.077±0.0100.258±0.0120.164±0.011miRNA-223-3p抑制组30.134±0.0090.182±0.0090.293±0.013t7.3388.77613.121P0.0020.001<0.001

2.6miRNA-223-3p对MKN-28细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响miRNA-223-3p抑制组与miRNA-223-3p对照组相比，JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达均降低。见图3、表2。

图3 miRNA-223-3p对MKN-28细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响表2 2组MKN-28细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的比较

组别nJAK2p-STAT3STAT3miRNA-223-3p对照组30.259±0.0150.248±0.0160.487±0.019miRNA-223-3p抑制组30.147±0.0110.124±0.0140.279±0.016t10.429 14.504 10.102 P0.001 <0.001 0.001

2.7miRNA-223-3p对MKN-28细胞迁移的影响结果显示，miRNA-223-3p抑制组细胞迁移数(114.8±14.3)低于miRNA-223-3p对照组(185.6±8.9)(t=7.281，P=0.002)。

3 讨论

在正常组织和癌旁组织中，miRNA的表达存在很大的差异，这些存在差异的miRNA可能作为癌基因或是抑癌基因在肿瘤的发生中发挥作用[10-12]。研究[11]显示，miRNA-223-3p参与实体肿瘤的发生，在胃癌患者胃黏膜组织中表达上调。本研究也发现miRNA-223-3p在胃癌组织中上调表达，这与上述研究结果一致。miRNA-223-3p可影响多种肿瘤发生发展，如miRNA-223可促进胰腺癌细胞增殖和迁移能力，上调结肠癌中miRNA-223-3p表达可抑制癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡和阻滞细胞于G1期[13]。胃癌中miRNA-223-3p研究较少，有研究[14]发现miRNA-223-3p可通过靶向EPB41L3促进胃癌的生长、迁移和侵袭，下调胃癌细胞中miRNA-223-3p表达可抑制细胞的增殖[15]。本研究旨在观察miRNA-223-3p表达对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响，结果显示，转染miRNA-223-3p抑制物能显著抑制细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡。

JAK2/STAT3途径是STAT3信号转导与转录激活的关键途径[16-17]。研究[18]显示，大多数恶性肿瘤中有JAK、STAT的异常表达和过度激活，尤其是STAT3的激活。STAT3可通过调节下游的Bcl-2、Bax等调控细胞的凋亡，影响恶性肿瘤的发生[19]。胃癌中抑制JAK2/STAT3信号可抑制癌细胞生长[20]。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax分别属于抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，影响细胞凋亡关键因素是Bcl-2/Bax比值，比值下降时细胞出现凋亡[21-22]。Caspase3是Caspase家族的代表，是一个凋亡执行者，它可以与Bcl-2共同作用促进细胞的凋亡[23]。本研究结果显示，下调miRNA-223-3p表达可降低JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达，上调Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达，提示miRNA-223-3p对胃癌细胞生长的影响与抑制JAK2/STAT3信号有关。

综上，在胃癌组织中miRNA-223-3p呈现高表达，下调 miRNA-223-3p表达能显著抑制细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，其作用机制与JAK2/STAT3信号通路的调节有关。该研究结果为胃癌的诊断及治疗提供了依据。