基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究＊

覃 桂，聂 晶，张 飞，胡炳雄，肖 凌，汪 波

（湖北省药品监督检验研究院 武汉 430075）

翠云草（Selaginella uncinata）系蕨类卷柏科卷柏属植物，该属植物在全世界有700余种，在我国分布较为广泛，约有60～70种[1]，其中22种有药用记载，在湖北分布的药用种类达14种，以全草入药，具有清热、解毒、降糖、镇痛等多种功效[2,3]，得到广泛关注和大量的研究，卷柏（S.tamariscina）和垫状卷柏（S.pulvinata）作为卷柏药材基源收载入《中国药典》。

作为民间广泛使用的中草药品种，翠云草早在《神农本草经》中就有记载，具有清热利湿、止咳止血、抗菌消炎等功效[4]，现代药理研究表明其还具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等药理作用[5,6]，应用于黄疸、肠炎、肾炎水肿、肺结核咳血、风湿性关节炎、外伤出血等症的治疗，具有较高的药用价值。然而，卷柏属植物纷繁多样、分类复杂[7,8]，不同种植物间的鉴别性状存在交叉重叠[9,10]，且调查发现不同生境或不同采收期样本的性状存在明显差异，给翠云草的准确鉴定带来很大困难，给正确用药造成障碍。因此，建立快速准确鉴定翠云草的方法对该重要药用植物的开发及应用至关重要。

本研究基于卷柏属药用植物DNA条形码鉴定序列种间变异位点信息，针对翠云草设计特异引物及TaqMan探针，通过实时荧光定量PCR检测法对目的片段进行扩增，比较翠云草及其同属植物特异片段扩增的荧光信号差异，区分翠云草及其近源物种，为翠云草的快速鉴定提供检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料分别收集自湖北、湖南、广西等地（表1），共涉及卷柏属11种32批，所有样本均经由中南民族大学药学院万定荣教授鉴定。对所收集的样本以75%乙醇擦拭清洁表面后分别编号，硅胶干燥后保存于湖北省药品监督检验研究院中药检验所。其余34物种的103条ITS2序列均来源于Genbank数据库（表2）。

表1 实验样品信息表

1.2 样品DNA提取、PCR扩增与测序

1.2.1 DNA提取

取干燥组织约30 mg，用高通量组织研磨仪（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末状，使用植物DNA提取试剂盒（TIANGEN Biotech（Beijing）Co.,Ltd DP305-02）提取总DNA，并对该试剂盒抽提及沉淀DNA的方式作如下改进：65℃水浴10 min改为水浴过夜，使用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提2次，使用预冷的异丙醇放入-20℃冰箱沉淀DNA。

1.2.2 PCR扩增

PCR扩增反应体系及扩增程序等参考中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则（《中华人民共和国药典》2015年版通则9107），上游引物2F：CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA；下游引物3R：CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCC ACCPCR，扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对条带单一且清晰的PCR产物纯化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）测序仪进行双向测序。

1.2.3 序列拼接和数据分析

测序峰图釆用序列拼接软件CodonCode Aligner V3.71（CodonCode，Dedham，MA，USA）校对拼接，去除低质量序列及引物区。采用基于隐马尔可夫模型的HMM注释方法去除两端5.8S和28S区段即可获得ITS2间隔区序列[12]。然后，将所有序列用软件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比对[13]，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，各分支支持率通过Bootstrap（1000次重复）进行检验。

1.3 TaqMan探针法鉴定翠云草药材

1.3.1 引物、探针的设计及合成

根据实验获得的11物种32条序列及GenBank数据库中下载的34物种103条序列的序列特征，针对翠云草种内保守及种间高变异区域，使用引物设计软件Primer Express v3.0和primer3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计筛选得到一组特异引物和TaqMan探针，预期扩增片段长度为101 bp，引物及探针委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。探针5′端用FAM标记，3′端用TAMRA标记，引物和探针序列见表3。

1.3.2 荧光PCR反应及评价验证

基于TaqMan探针的荧光定量PCR反应是在ABI stepone plus实时荧光定量PCR仪上完成，按照Goldstar TaqMan Mixture（CWBIO，CW2625）提供的标准操作流程操作，25µL反应体系：2×GoldStar TaqMan Mixture 12.5µL，引物CYC-R 1µL，引物CYC-F 1µL，探针 CYC-P 1 µL，50×High ROX 1 µL，模板 1 µL，ddH2O 7.5 µL；荧光定量PCR扩增程序：95°C预变性10 min；95°C变性15 s，60°C退火60 s，72°C延伸45 s，30个循环；72°C延伸10 min，收集荧光信号。以翠云草DNA为阳性样品，以除翠云草外的卷柏属其他样本DNA为阴性样品，进行荧光PCR反应检测以确定该方法的特异性；以从不同翠云草样品中提取的DNA为模板，应用荧光PCR检测法进行组内试验与组间试验，每个样本做3次平行检测，以确定本方法的可重复性；分别称取1 mg、2 mg、4 mg、10 mg和30 mg的翠云草样品提取DNA，以其为模板进行荧光PCR反应，探讨该方法灵敏度。

表2 GenBank数据库获得卷柏属植物ITS2序列登录号信息

2 结果与分析

2.1 种间ITS2序列聚类分析

基于本实验所得卷柏属序列及Genbank上已发表序列，以邻接（NJ）法构建系统聚类树（图1）。聚类分析表明：翠云草能单独成支，红枝卷柏、伏地卷柏、疏松卷柏、镰叶卷柏、中华卷柏、深绿卷柏、疏叶卷柏也分别与其余物种有明显分界，而异穗卷柏与剑叶卷柏、江南卷柏与兖州卷柏、卷柏与垫状卷柏之间遗传关系较近，并未呈现较好单系性。本实验采集的样品中，同一产地或产地相近（江南卷柏6、7、12、14、15、10、13号样品）的样品先分别聚类，再与产地较远的其余样品（江南卷柏8、9号样品）聚类，说明江南卷柏产地相距越远，遗传差异越明显。该实验结果表明，ITS2序列能较好的用于翠云草的聚类分析及鉴定，也能较明显的揭示卷柏属植物间遗传差异，为卷柏属药用植物资源分类鉴定提供了新途径。

表3 引物与探针序列

2.2 翠云草实时荧光定量PCR快速检测

2.2.1 特异性验证结果

通过RT-PCR仪扩增，自动检测荧光信号强度曲线得到特异性验证结果见图2（A），翠云草样本荧光信号随着扩增循环数的增加逐步增强，上升趋势明显，信号强度与始终无明显信号强度的阴性样本差异显著（ΔRn值均相差1.0以上），该结果表明该方法能准确反映目标产物的扩增，引物具有良好的特异性。

2.2.2 重复性验证结果

取两批翠云草样本分2组，每组内同一样本做3次平行试验，得到相应扩增曲线见图2（B），组间不同翠云草样本及同组内相同翠云草样本的平行实验结果表明：30个循环后，翠云草样本ΔRn值均大于1.0，每份样本PCR产物量基本一致，曲线整体走势基本相同，该结果表明该方法具有良好重复性。

2.2.3 灵敏性验证结果。

图1 卷柏属131条序列聚类分析进化树

图2 特异性、重复性、灵敏性验证结果图

分别以5种不同取样量的翠云草样本DNA为模板，进行RT-PCR灵敏度分析见图2（C）。结果显示，当取样量在1 mg以上时，用建立的RT-PCR方法检测能产生较好的特异性扩增，阴性对照无明显特异性扩增，表明该方法具有较好灵敏性，可从低至1 mg的样品中提取DNA并得到有效检出。

3 讨论

3.1 ITS2序列在卷柏属药用植物翠云草鉴定中的作用

传统中药材鉴别主要集中于形态、显微及理化鉴别，随着分子生物学技术的日益成熟，DNA条形码鉴定技术因技术简便、鉴定准确、使用方便等特点已被广泛应用于中药鉴定[13,14、15]，以ITS2/ITS为主体鉴定序列的植物类中药材鉴定体系已收录入2015年版《中华人民共和国药典》，该序列对卷柏属植物也具有较高的鉴定效率[16]。在本研究在构建的系统进化树中，翠云草单独成支，可与其它物种很好区分，表明该序列对翠云草具有较高的鉴定能力，虽然江南卷柏、兖州卷柏、薄叶卷柏、垫状卷柏及藤卷柏未能单独聚为一支，但并不影响翠云草的鉴定。

3.2 荧光PCR在翠云草快速检测中的应用

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，能反应样品中靶DNA含量多少及动态变化，现亦被广泛应用于物种鉴定[17,18]，本研究基于实时荧光定量PCR检测技术，建立了翠云草快速鉴定新方法，并从特异性、重复性及灵敏性三方面进行了方法学验证。结果表明，通过直观信号图可将翠云草与常见同属近源物种样本有效区分，准确度高、耗时短，体现了该方法快速、高效、准确的鉴定特点。相较于形态学、显微结构特征、化学指纹图谱等的传统鉴定方法[19,20]，该方法特异性更强、污染小、自动化程度高、操作简便，并通过荧光信号强度的差异客观反应鉴定结果，实现了翠云草与其它近缘物种准确、高效的鉴定，弥补了传统鉴定方法的不足，为翠云草的快速、准确鉴定提供了新的技术途径，为保障翠云草临床用药的有效性提供了技术支持。