绵甜型白酒酒醅原核微生物群落结构分析

王 鹏， 蒋 超，常 强， 崔 磊，闫寅卓， 李 红， 刘海坡， 韩兴林，*

(1.中国食品发酵工业研究院， 北京 100027； 2.安徽文王酿酒股份有限公司， 安徽 临泉 236400； 3.中国酒业协会， 北京 100833)

中国白酒历史悠久、种类繁多，至此已经形成十二种香型白酒[1]。浓香型白酒作为我国传统白酒的典型风味之一，深受消费者喜爱，是我国白酒中最有影响力的酒种之一[2-3]。文王贡酒是安徽浓香型白酒的代表作之一，因为酒质绵软、醇甜，带有绵甜风格，所以也称之为绵甜型白酒。

浓香型白酒的生产是以酒醅为原料，以窖池为发酵容器，采用开放式的固态发酵模式进行的多菌种复合发酵[4-8]。浓香型白酒的酿造过程与微生物菌群的演化交替密不可分，窖内微生物经过长期的驯化和发展，慢慢形成了独特的微生物群落。酒醅中富含丰富的微生物，这些微生物的代谢产物是形成白酒独特风味与口感的重要物质基础[9]。因此，研究白酒发酵过程中酒醅微生物群落结构可以了解白酒的发酵机理，解析酿造过程中的功能微生物，同时对白酒生产有着重要的指导意义[10]。

传统菌群分析采用涂布分离纯菌株，然后进行分子鉴定，操作复杂，同时绝大多数的微生物是不能够被培养或者很难被培养，大量菌群的遗漏导致检测结果不准确[11]。高通量测序技术可以满足对多个样品中的微生物进行深入分析，其主要特点是通量高、速度快、准确度高、实时检测、数据信息量大等，能在很短时间内获取大量的数据[12-13]。本文利用高通量测序技术对绵甜型白酒酒醅中原核微生物的构成进行分析，以期为绵甜型白酒功能微生物的筛选应用，优化发酵工艺提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖池1号、窖池2号：安徽文王酿酒股份有限公司中试车间浓香型窖池；Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒，美国MP公司。

1.2 仪器与设备

Miseq型高通量测序仪，美国Illumina公司；BioSpec-nano型核酸蛋白检测仪，德国Eppendorf公司；2-16N型高速微量离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司；Voetex-genie 2型多功能涡旋振荡器，北京开源国创科技有限公司；Mini Beadbeater型研磨珠均质器，北京优尼康生物科技有限公司；ES500型电子天平，上海仁沃实业发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1取样方法

选取文王贡酒的2个窖池，跟踪采集窖内不同空间位置及不同发酵阶段的酒醅。取样位置分为上中下3层，其中窖深1.6 m，表层面糟0.2 m，上层取样点(距窖顶0.6 m处)、中层取样点(距窖顶1 m处)、下层取样点(距窖顶1.4 m处)。

文王贡酒发酵车间窖池发酵周期为46 d，取样时间设为发酵1、7、13、21、31、46 d。发酵期间窖池密封，取样时使用取样器通过取样口直接插入酒醅进行取样，不破坏窖池整体的密封环境。每层取3点酒醅样品均匀混合，混匀后，分装于无菌真空塑料袋，置于冰盒运回实验室，-20 ℃保藏，尽快进行DNA提取实验。

本实验样本DXLY和DXHY(X表示天数，Y表示窖池取样点的空间位置)分别表示1号窖池酒醅样品和2号窖池酒醅样品。

1.3.2酒醅中DNA的提取

1)加入300 mg研磨好的酒醅粉末到Lysing Matrix E管中。加入978 μL磷酸钠缓冲液和122 μL MT缓冲液。

2)在多功能涡旋振荡器中处理1)中离心管30 s。

3)将Lysing Matrix E管以14 000 r/min离心10 min。

4)将上清液转移到一个新的2 mL离心管中，加入250 μL PPS，并用手摇10次进行混合。

5)以14 000 r/min离心5 min，至形成球状沉淀物，将上清液转移到一个新的5 mL离心管，并加入1 mL Binding Matrix Suspension。

6)放到旋转体或用手颠倒2 min，使DNA附着到基质上，把离心管放到架子上静置3 min。

7)小心去除500 μL上清液，避免扰动沉淀的Binding Matrix，重悬剩余的上清液；转移大约600 μL的混合液到一个SPINTMFilter中，以14 000 r·min-1离心1 min；将SPINTMFilter下面收集管中的液体倒掉；重复转移混合液过程直到剩余混合液全部转移离心完(1.5 mL酒醅样品一般要转移3次)。

8)加入500 μL SEWS-M到SPINTMFilter中，以14 000 r/min离心1 min；将SPINTMFilter下面收集管中的液体轻轻倒掉，再以14 000 r/min离心2 min，去除基质中的SEWS-M。

9)将SPINTMFilter放到一个新的收集管中，在室温下风干SPINTMFilter 5 min。

10)加入50 μL DES，用移液枪枪头在滤膜上轻轻搅动，使滤膜上的沉淀物重悬，从而使DNA有效洗提；以14 000 r/min离心1 min，使DNA转移到收集管中。

11)处理好的样品置于-20 ℃保藏、备用。

1.3.3酒醅DNA浓度及纯度检验

采用核酸蛋白检测仪检测酒醅样品DNA浓度及纯度。

2 结果与分析

2.1 酒醅DNA浓度及纯度检测结果

通过对酒醅样品进行核酸蛋白检测，得到酒醅样品的DNA浓度和纯度，结果见表1。由表1可以看出，从酒醅中提取的DNA质量浓度均在13 μg/mL以上，其OD260/280值在1.5～2.1。检测所得曲线线性较好，适宜于PCR扩增及后期的高通量测序。

表1 酒醅样品浓度及纯度

2.2 酒醅中原核微生物群落多样性指数分析

用Alpha Diversity分析酒醅样品内的群落多样性。对不同样品在不同一致性阈值水平(默认提供97%、95%两个阈值)下的Alpha Diversity分析的指数进行统计[14]。其中，97%水平下聚类成为一个OTU的序列被认为可能是源自于同一个种的序列；95%水平下聚类成为一个OTU的序列被认为可能是源自于同一个属的序列[15]。Shannon、Simpson、Chao1和ACE是反应样品丰富度和多样性的重要指标，微生物群落多样性与Shannon成正比，Shannon越大，微生物群落多样越丰富，结果见表2。由表2可以看出，细菌群落检测覆盖率均在99.4%以上，基本可以反映出酒醅样品中全部的原核微生物多样性及结构。从样品种类来看，1号窖池酒醅中的原核微生物多样性要高于2号窖池酒醅中的原核微生物。

表2 酒醅样品中原核微生物群落多样性指数

图1 细菌的操作分类单元维恩图Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic units of bacteria

2.3 OTU分析

为了研究酒醅中物种的组成多样性信息，用Uparse软件对所有酒醅样品的全部Effective Tags 序列聚类，提供以97%的一致性将序列聚类成为OTUs结果[16]。按所有酒醅样品间序列最小值对OTUs聚类结果进行标准化处理后，根据OTUs聚类分析结果和研究需求，分析不同酒醅样品之间的OTUs的共有、特有信息，并绘制韦恩图，展示结果见图1。

由图1(a)可以看出，1号、2号窖池酒醅中分别含有细菌种类1 304、1 036个。1号和2号窖池酒醅中含有相同种类细菌914个，可以看出，1号窖池和2号窖池酒醅中的原核微生物种类相似度较高。

由图1(b)可以看出，1号窖池第1天上、中、下层酒醅中分别含有细菌种类827、816、790个，上、中、下三层酒醅中含有相同种类的细菌489个。由图1(c)可以看出，2号窖池第1天上、中、下层酒醅中分别含有细菌种类585、572、663个，上、中、下三层酒醅中含有相同种类的细菌363个。由图1(d)可以看出，1号窖池第46天上、中、下层酒醅中分别含有细菌种类160、212、269个，上、中、下三层酒醅中含有相同种类的细菌110个。由图1(e)可以看出，2号窖池第46天上、中、下层酒醅中分别含有细菌种类129、117、107个，含有相同种类的细菌59个。由此可以看出，同一个窖池中原核微生物种类相似度很高，1号窖池中原核微生物的种类要高于2号窖池；同时，随着发酵的进行，窖内各种营养物质被逐渐消耗，酒醅酸度增大，酒精含量升高，窖内环境变得更加恶劣，不适于微生物的生长，致使2个窖池酒醅中的细菌种类不断减少。

2.4 在门水平上酒醅中原核微生物群落结构分析

酒醅中不同微生物群落分布和种类差异对产酒品质具有重要的影响。Uparse构建OTUs时会选取代表性序列，将这些代表性序列集合用RDP Classifier与GreenGene数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)[17-18]。根据物种注释，统计每个样品在各分类水平上的序列数目，根据物种注释结果，选取在门分类水平上最大相对丰度排名前十的门，生成的物种相对丰度分布柱形图见图2。

由图2可以看出，1号窖池和2号窖池酒醅中的原核微生物菌群种类相似，同时菌群种类变化趋势相同。1号窖池和2号窖池酒醅中的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。优势菌门的数量由多到少排列顺序为：Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Gemmatimonadetes。发酵前期菌群种类较多，这是由于窖内营养物质丰富，同时氧气含量较高，酒醅酸度较低，所以一些好氧细菌，例如Actinobacteria丰度较大。但是随着发酵的进行和窖内微环境的改变，优势菌种越来越占有优势，致使其他菌群的数量逐渐减少。随着发酵的进行，Firmicutes的丰度越来越大，分析原因主要是由于窖内各种营养物质的逐渐消耗，且酒醅酸度和酒精含量逐渐加大，窖内微生态环境变得更加恶劣，从而不适于大量微生物的生长，造成窖内微生物死亡，仅有少量适应酸性厌氧环境的微生物生长。很多厚壁菌可以产生内生孢子，它可以抵抗极端环境，所以在发酵中后期厚壁菌门的丰度最大。

图2 在门分类水平上酒醅样品细菌菌群所占比例Fig.2 Relative proportions of bacterial flora of fermented grains samples at phylum level

2.5 在属水平上酒醅中原核微生物群落结构分析

根据所有酒醅样品在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35的属及其在每个酒醅样品中的丰度信息绘制热图，并从分类信息和样品间差异两个层面进行聚类，便于结果展示和信息发现，从而找出酒醅样品中聚集较多的物种，结果展示见图3。

图中的每一个小方格代表所对应酒醅样品中(横坐标)菌(纵坐标)的相对丰度，方格红色越红说明该菌的相对丰度越高。图3 在属分类水平上酒醅样品细菌菌群构成的热图Fig.3 Heatmap of bacterial flora of fermented grains samples at genus level

由图3可以看出，酒醅样品中原核微生物可分为Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、Euryarchaeota、Firmicutes、Proteobacteria，共7个门。1号窖池上层细菌中，大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-shigella)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、芽孢杆菌属(Bacillus)、谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)、甲烷细菌属(Methanobacterium)相对丰度较高。1号窖池中层细菌中，谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)相对丰度较高。2号窖池中层细菌中，Malikia、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、栖热菌属(Thermus)、硫化细菌属(Vulcaniibacterium)、链球菌属(Streptococcus)相对丰度较高。2号窖池下层细菌中，拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、雷氏菌属(Ralstonia)相对丰度较高。1号窖池第7天的酒醅样品中，类芽孢杆菌属(Macellibacteroides)、拟杆菌属(Bacteroides)、森氏梭状芽孢杆菌属1(Clostridiumsensustricto1)相对丰度较高。1号窖池第13天的酒醅样品中，瘤胃杆菌属(Rummeliibacillus)和醋酸杆菌属(Acetobacter)相对丰度较高。1号窖池第46天下层酒醅样品中，普雷沃氏菌属9(Prevotella9)相对丰度较高。在发酵前期，相对丰度较高的菌属较多，随着发酵的进行，相对丰度较高的菌属数量越来越少。

3 结 论

本实验通过对酒醅样品进行高通量测序，得到结果：

1)通过对酒醅中原核微生物群落多样性指数分析可以得到，1号窖池酒醅中的原核微生物多样性要高于2号窖池酒醅中的原核微生物。

2)为了研究酒醅中物种的组成多样性信息，对酒醅样品进行OTU分析，可以得出随着发酵的进行2个窖池酒醅中的细菌种类在不断减少。1号窖池酒醅和2号窖池酒醅的原核微生物种类相似度较高。在同一窖池中，不同的空间位置，原核微生物种类相似度很高。

3)在门水平上酒醅中原核微生物群落结构分析，可以得到1号窖池和2号窖池酒醅中的原核微生物菌群种类相似，同时菌群种类变化趋势相同。优势菌门的数量由多到少排列顺序为：Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Gemmatimonadetes。随着发酵的进行和窖内微环境的改变，窖内的菌群种类逐渐减少，不适于大量微生物的生长，而厚壁菌产生的内生孢子可以抵抗极端环境，所以在发酵中后期厚壁菌门的丰度最大。

4)在属水平上酒醅中原核微生物群落结构分析，可以得到1号窖池酒醅中Escherichia-shigella，Psychrobacter，Sporosarcina，Bacillus，Glutamicibacter，Methanobacterium，Macellibacteroides，Bacteroides，Clostridiumsensustricto1，Rummeliibacillus，Acetobacter，Prevotella9相对丰度较高。2号窖池酒醅中Malikia，Dechloromonas，Thermus，Vulcaniibacterium，Streptococcus，Nocardiopsis，Ralstonia相对丰度较高。随着发酵的进行，相对丰度较高的菌属数量越来越少。