潮汕牛肉丸煮制前后关键性香气成分对比分析

石华治， 王 娟，刘玉平， 彭秋菊，黄明泉,*， 刘英俏，黄 佳， 张 倩

(1.北京天利海香精香料有限公司， 北京 101200; 2.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室， 北京 100048; 3.北京味食源食品科技有限公司， 北京 101200)

潮汕牛肉丸是粤菜三大流派中东江菜的代表之一。潮汕牛肉丸独特的制作工艺(洗肉、沥干、绞肉、搅拌、混料、定型、沥干等)使其具有独特的香味[1]。风味是食品的重要属性之一，而牛肉丸在制作、存储和运输过程中易发生风味劣变。因此了解和明晰牛肉丸的风味物质，有利于完善牛肉丸品质评价标准，对储藏加工后牛肉丸的风味保持和牛肉香精香料的生产有指导意义。

挥发性风味化合物的提取方法有固相微萃取、搅拌棒吸附萃取、同时蒸馏萃取、溶剂辅助风味蒸发萃取等[2]。 SPME[3]是集样品采样、富集和进样为一体的顶空萃取方法，简便、经济、效率高、无溶剂、实用性强，被广泛应用于挥发性物质分析中。

本实验采用SPME结合GC-O-MS分析生牛肉丸和熟牛肉丸的香气活性物质，同时结合香气活性值鉴定生牛肉丸和熟牛肉丸的关键性香气活性化合物。旨为牛肉丸的生产加工、质量控制及风味评价提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品：万壮牛肉丸(配料为牛肉、猪肉、淀粉、大蒜、花生、芝麻、食用植物油、香辛调味料、酱油、味精、白砂糖、食用盐、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠)，塑料袋包装，规格500 g，广东潮汕万壮食品有限公司。

试剂：丙二酸二乙酯(内标)、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯乙醇、乙基麦芽酚、甲硫醇等标准品(均为色谱纯，纯度>95%)，百灵威科技有限公司。

1.2 实验仪器与设备

7890B-5977A型气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；ODP3型嗅闻检测器，德国Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS (灰色)萃取纤维(2 cm)、手动固相微萃取手柄，美国Supleco公司；DF-lO1S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器责任有限公司；T-403型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品前处理

1.3.1.1 肉丸样品制备

生牛肉丸：取生牛肉丸一个，用搅拌机粉碎至稠状没有大块颗粒。称取(8.000±0.002) g至40 mL萃取小瓶中，加入内标丙二酸二乙酯20 μL(质量浓度为159.97 μg/mL)，震荡均匀。

熟牛肉丸：取生牛肉丸一个，放入盛有500 mL自来水的锅中加热至沸腾，继续煮制12 min。取出煮熟的牛肉丸，待晾干至表面没有滴状水珠后用搅拌机粉碎。取样步骤操作与生牛肉丸一致。

1.3.1.2 固相微萃取

将50/30 μm灰色萃取头(碳分子筛/聚二乙烯苯/聚二甲基硅氧烷，DVB/CAR/PDMS)在250 ℃进样口老化30 min。然后将准备好的样品瓶放置在45 ℃水浴锅中平衡20 min，插入老化好的萃取头萃取40 min，拔出萃取头插入到气质联机的进样口，在250 ℃下解析5 min[4]。

1.3.1.3 仪器分析条件

气相色谱条件：DB-WAX (30.0 m×250 mm×0.25 μm) 极性色谱柱；升温程序为起始温度40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至80 ℃，再以4 ℃/min的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持5 min；载气(He，纯度99.999%)流速1.0 mL/min，不分流。

质谱条件：电子电离(EI)源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描模式为Scan，扫描质量范围m/z为35～350u。

嗅觉检测器条件：从色谱柱流出的馏分以1∶1的比例分别进入嗅觉检测器和质谱检测器，传输线的温度为250 ℃，嗅闻口温度220 ℃。

1.3.2定性分析

采用NIST14谱库检索匹配值，保留匹配度大于70的化合物并结合嗅闻和保留指数进行定性。

嗅闻定性：结合NIST14谱库检索和化合物的香气特征与对应标准品对比。

保留指数(retention index，RI)定性：通过公式(1)计算RI，并与文献中报道的RI值做对比，取绝对值相差10以内的化合物。

RI=100n+100×t-tntn+1-tn。

(1)

式(1)中,n和n+1分别为未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间(tn

1.3.3GC-O分析

香气频率法：对5位有GC-O 嗅闻经验的嗅闻人员用标准物质进行嗅闻训练。要求嗅闻人员在嗅闻过程中记录香气物质出现的时间、香气特征。嗅闻到化合物的次数即为该物质的香气频率，记录3位及以上评价人员所闻到的物质。

1.3.4定量分析

采用内标法定量，通过样品中各组分的峰面积与内标峰面积的比值和样品中各组分浓度与内标浓度比值，求得各挥发性成分的含量。

1.3.5香气活性值的计算

香气活性化合物的OAV值计算见式(2)：

OAV=Ci/OTi。

(2)

式(2)中，Ci为化合物的质量浓度，μg/kg；OTi为该化合物在水中的阈值，μg/kg。

2 结果与讨论

2.1 牛肉丸挥发性成分分析

经SPME-GC-O-MS分析牛肉丸煮制前后挥发性物质，通过谱库检索、保留指数计算、嗅闻和标准品对比进行定性分析，所得结果见表1。

由表1可知，在煮制前后牛肉丸中共鉴定出化合物42种，其中生牛肉丸中鉴定出29种挥发性化合物，熟牛肉丸中鉴定出35种化合物。生牛肉丸挥发性成分包括醇类4种，醛类6种，含硫类9种，酚类2种，杂环类3种，烃类5种；熟牛肉丸化合物种文献保留指数均来自NIST14谱库，“-”表示未检测到该化合物。

表1 牛肉丸煮制前后SPME-GC-O-MS分析结果

类更加多样化，含有醇类3种，醛类6种，酮类1种，含硫类9种，酚类1种，杂环类4种，烃类8种，酯类2种，酸类1种。

含硫化合物主要来源于美拉德反应或氨基酸热解，具有非常小的阈值并且是牛肉中重要的风味物质[5]。在2种牛肉丸中共检测到11种含硫化合物，包括烯丙硫醇、硫化丙烯、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、甲基烯丙基二硫醚、二烯丙基二硫醚、2-乙酰基噻唑、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-乙烯基-1,3-二噻烷、3-烯丙基-1,2-二硫杂环己-5-烯、3-烯丙基-1,2-二硫杂环己-4-烯，其中甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、2-乙酰基噻唑等化合物都是牛肉中重要的挥发性物质[6-8]。由表1可知，生牛肉丸中含硫物质的质量比远远高于其他类物质(1 123.24 μg/kg)，这与其他研究报道的生牛肉中的含硫物质较少不同[9]。在煮制前后牛肉丸中都检测到的3-烯丙基-1,2-二硫杂环己-5-烯和3-烯丙基-1,2-二硫杂环己-4-烯两种化合物尚未在牛肉或猪肉相关的文献中被报道，而孙颖等[10]、张娜等[11]研究表明它们是蒜和蒜薹的关键香气成分；其次，2-乙酰基噻唑也存在于猪肉和芝麻中[12]。可见，牛肉丸制作时添加的辅料为牛肉丸贡献了大量的含硫化合物。与生牛肉丸相比，熟牛肉丸中的含硫化合物种类增加，但总含量却明显减少。这是由于煮制过程中发生了硫胺素的降解和美拉德反应，从而生成了新的含硫化合物，使其种类增加。同时，由于含硫化合物易挥发，在高温煮制过程中损失，导致其含量在熟牛肉丸中降低。

醛类化合物是牛肉丸中重要的风味物质[13]，煮制前后的牛肉丸中共检测到了戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛7种化合物，但其在熟牛肉丸中质量比较大(283.9μg/kg)，是生牛肉丸的1.22倍。醛类来源于脂质氧化降解作用[14-15]，这些醛类化合物在加热煮制过程中更易产生。醇通常由脂质氧化生成的自由基促进糖分解而产生[9]，在2种牛肉丸中都检测到1-戊醇、正己醇、1-辛醇，且煮制后的牛肉丸醇类物质含量明显减少，这与Wang等[9]的结果一致，醇类物质经煮制后含量降低，可能是由于煮制后醇类物质被氧化或发生酯化反应生产其他物质。

酯类、酸类、酮类物质仅在熟牛肉丸中检测到，这是由于牛肉丸中的脂类在煮制过程中受热分解出的不饱和脂肪酸在加热时发生氧化作用生成了酯类、酸类、酮类[7]。熟牛肉丸中检测到的乙酸丁酯、苯甲酸甲酯、2,3-辛二酮和乙酸也是炖煮牛肉的重要挥发性物质[13]。煮制前后的牛肉丸中都检测到2-戊基呋喃、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪杂环化合物。2-戊基呋喃主要来源于亚油酸的氧化降解，2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪可由氨基酸Strecker降解产生[13]。这些也是牛肉丸辅料(酱油、芝麻)中重要的香气成分[8,16]。熟牛肉丸中检测到的吡嗪类化合物与生牛肉丸相比总含量没有明显变化，这是由于本实验是用水煮牛肉丸，煮制温度不超过100 ℃，而吡嗪等杂环化合物易在高温下形成。2-蒎烯、桉树脑、柠檬烯等萜烯类化合物，一部分来源于牛肉丸中添加的香辛料[17]，另一部分可能由于吃了饲料后的牛，其牛肉本身含有这些成分[18]。

2.2 GC-O-MS香气活性成分分析

通过GC-O-MS嗅闻对牛肉丸煮制前后的香气活性成分进行鉴定，并根据其OAV确定出牛肉丸煮制前后关键性香气成分(见表2)。

由表2知，通过GC-O-MS分析，在煮制前后的牛肉丸中共鉴定出12种香气活性物质，包括呈芥末味、葱香、蒜香的含硫化合物、呈青草香和脂肪香的醛类化合物以及甜香的苯乙醇和乙基麦芽酚。生牛肉丸中嗅闻到呈腐臭味的物质，其在GC-O-MS的质谱图中没有出峰，但却能嗅闻到，根据其特征香并用标准品定性，确认其为甲硫醇。这是由于甲硫醇在肉丸中含量较低，而其阈值较小的原因。

生牛肉丸中共鉴定出12种香气活性物质，OAV大于1的有9种。二烯丙基硫醚(OAV=201，葱香)、二烯丙基二硫醚(OAV=109，芥末味)、甲基烯丙基硫醚(OAV=79，芥末味)、反式-2-辛烯醛(OAV=48，脂香)、己醛(OAV=35，青草香)、壬醛(OAV=35，油脂味)这6种物质OAV最大，对生牛肉丸香气有重要贡献。这些物质贡献了芥末味、蒜香、葱香、脂肪香、青草香和油脂味等，而据Byrne等[21]报道生牛肉具有非常微弱的血腥味，这表明制作过程中添加的辅料对牛肉丸的香气有非常重要的影响，并使生牛肉丸的香气更加丰富。熟牛肉丸中共鉴定出8种香气物质，OAV大于1的有8种。二烯丙基硫醚(OAV=631，葱香)、己醛(OAV=42，青草香)、壬醛(OAV=33，油脂味)、二烯丙基二硫醚(OAV=31，芥末味)这4种化合物OAV最大，对熟牛肉丸香气有重要贡献作用。

表2 牛肉丸煮制前后GC-O-MS香气活性物质分析

“ * ”表示在生牛肉丸中闻到特征风味，但GC-MS未检测到； “-”表示该化合物在熟牛肉丸中未检测到也未闻到该化合物的特征风味。

有研究表明甲基烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲硫醇是大蒜的重要风味活性物质，而甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚也是煮牛肉重要的风味活性成分[22]。甲基烯丙基硫醚(芥末香)、二烯丙基硫醚(葱香)在生、熟牛肉丸中的OAV较大，对生、熟牛肉丸的香气都有重要贡献。甲基烯丙基硫醚(芥末味)、甲基烯丙基二硫醚(蒜香)、二烯丙基二硫醚(芥末味)在生牛肉丸中的OAV较大，煮制后OAV变小。Shahidi等[23]研究表明在牛肉热加工过程中含硫化合物含量会减少并维持在合理水平，避免含硫化合物在较高浓度时呈现出的恶臭味，可使牛肉整体香气平衡。

侯莉等[13]的研究中表明己醛、庚醛、辛醛、壬醛、乙基麦芽酚是炖煮牛肉中的香气活性物质，这与本研究结果一致。己醛、庚醛、辛醛在熟牛肉丸中OAV变大，呈青草香、葱香和油脂味，对煮牛肉丸的香气贡献显著。这是由于牛肉丸在煮制过程中脂质氧化成醛类，使其含量增加而OAV随之变大[14-15]。反式-2-辛烯醛在生牛肉丸中OAV较大(48)而熟牛肉丸中未嗅闻到，可能因为反式-2-辛烯醛是不饱和醛，在煮制过程中易被氧化或降解。

经GC-O-MS嗅闻分析和OAV筛选，确认出生牛肉丸关键香气成分为二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、反式-2-辛烯醛、己醛、壬醛，而熟牛肉丸关键性香气成分为二烯丙基硫醚、己醛、壬醛、二烯丙基二硫醚。二烯丙基硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基二硫醚、反-2-辛烯醛、己醛等不仅在生牛肉丸和熟牛肉丸中都有较大的OAV，且经过煮制后这些物质的OAV有显著变化，最终确认这6种化合物是导致生牛肉丸煮制风味变化的关键性香气成分。

3 结 论

研究通过SPME-GC-O-MS对比分析了生牛肉丸和熟牛肉丸中的挥发性香气成分，生牛肉丸中检测到30种，而熟牛肉丸中检测到35种。通过GC-O-MS筛选香气活性物质并比较其OAV变化，确定生牛肉丸的关键香气活性物质为二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基硫醚、反式-2-辛烯醛己醛、壬醛，而熟牛肉丸中关键香气活性物质为二烯丙基硫醚、己醛、壬醛、二烯丙基二硫醚，其中二烯丙基硫醚、甲基烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、甲基烯丙基二硫醚、反式-2-辛烯醛、己醛是导致生牛肉丸煮熟风味变化的关键性香气成分。

由于牛肉丸在制作过程中添加了大蒜、芝麻、酱油等辅料和香辛料，使得生牛肉丸中含硫化合物种类和含量较多，且贡献蒜香、葱香、脂香等香气使得生牛肉丸香气比生牛肉丰富；而牛肉丸煮制时发生了硫胺素的降解、美拉德反应以及脂质氧化等造成其酯类、酸类、酮类、醛类化合物种类和含量增加，含硫化合物含量减少，芥末味和蒜香贡献减小，使得熟牛肉丸香气更加柔和。

本实验通过原材料和煮制工艺对比分析了潮汕牛肉丸煮制前后关键性香气成分及其差异，对牛肉丸的制作、运输和冷藏过程中的品质控制具有一定的参考价值；而对于煮制前后潮汕牛肉丸关键性香气成分与辅料添加的具体关系还需进一步研究，从而为牛肉丸的品质升级和产品开发提供指导。