稳定同位素稀释离子色谱-三重四极杆质谱法测定血浆和尿液中的氟乙酸

张晓艺, 张秀尧, 蔡欣欣, 李瑞芬

(温州市疾病预防控制中心, 浙江 温州 325001)

氟乙酸钠和氟乙酰胺均为有机氟类杀鼠剂,大鼠口服的半数致死剂量为0.22 mg/kg,人口服半数致死量为0.1～10 mg/kg,属A级有机剧毒物质。氟乙酸钠和氟乙酰胺进入机体内均会被代谢生成氟乙酸(MFA),其化学结构见图1。氟乙酸可使三羧酸循环中断,引起生理和生化功能障碍,甚至可以造成神经系统损害而引起死亡。氟乙酸钠和氟乙酰胺的毒性强,起效快,致死率高,容易引起二次中毒,我国于1982年就明令禁止其生产、销售和使用。但新西兰、美国和以色列等国仍允许使用[1,2]。据报道[3，4]某些天然植物也含有氟乙酸类物质,曾引起家畜中毒事件。

图 1 氟乙酸的化学结构Fig. 1 Chemical structure of monofluoroacetic acid

氟乙酸为水溶性极性化合物,直接分析测定难度大,往往需要进行衍生化反应改变其化学性质,常用的分析方法有气相色谱法[5,6]、气相色谱-质谱法[7-9]、液相色谱荧光法[10-12]、液相色谱-质谱法[13],但均操作繁琐。有报道[14,15]采用离子色谱法直接测定血液中氟乙酸,但灵敏度较低,易受基体成分干扰而出现假阳性结果;陈学国等[16]采用反相色谱-质谱法直接测定血中氟乙酸,但氟乙酸在色谱柱的死时间附近出峰,基质干扰严重,方法灵敏度低;Xu等[17]利用亲水相互作用色谱(HILIC)-质谱法直接测定尿液中的氟乙酸,但方法易受样品基质影响,保留时间不稳定[18],灵敏度不高;Hamelina等[19]使用反相和阴离子交换混合机理的色谱柱(Primesep B2)进行分离,三重四极杆质谱法直接测定尿液中的氟乙酸。

近年来,离子色谱-三重四极杆质谱法(IC-MS/MS)在食品和环境中的应用越来越广泛[20-26],但在生物样品中的应用较少[27,28], Cai等[27]报道了IC-MS/MS测定血清中有毒杀鼠剂异杀鼠酮的检测方法,以Ionpac AS11色谱柱为分离柱,以甲醇-30 mmol/L KOH (10∶90, v/v)为流动相进行分离,采用电喷雾电离源，在负离子和MRM模式下检测,方法的定量限为0.5 ng/mL。Baygildiev等[28]建立了检测大鼠尿液中有机磷神经毒剂代谢产物甲基膦酸的IC-MS/MS方法,以实验室合成的阴离子交换树脂自填的色谱柱为分析柱,200 mmol/L 甲酸水溶液作为淋洗液,三重四极杆质谱检测,检出限为4 ng/mL。但采用离子色谱-三重四极杆质谱联用技术测定血浆和尿液中氟乙酸的检测方法鲜有文献报道。本文采用高氯酸超声提取,叔丁基甲醚萃取净化,离子色谱分离,三重四极杆质谱法直接测定,稳定同位素内标法定量。该方法灵敏、准确、精密、快速。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

离子色谱系统由Dionex ICS-1100离子色谱仪,RFC-30淋洗液自动发生器、ASRS 500电解再生抑制器和DV-AS自动进样器组成,变色龙工作站(7.22版)控制(美国Thermo Scientific公司); QTRAP 6500三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪,由Analyst 1.6.2软件控制(美国AB Sciex公司); Orion 5-star酸度计(美国Orion公司); 2510超声波清洗机(美国Branson公司); Multi Reax数显型多管旋涡混合器(德国Heidolph公司); 3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); 24孔N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超纯水器(法国Millipore公司)。

叔丁基甲醚(MTBE)为色谱纯(德国Merck公司);高氯酸为分析纯(上海桃浦化工厂);亲水聚四氟乙烯(hydrophilic PTFE)滤膜针式过滤头(直径：13 mm,孔径：0.22 μm,上海安谱实验科技股份有限公司);氟乙酸钠标准物质(纯度97% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司);13C2-氟乙酸钠同位素标准物质(新西兰BDG Synthesis公司)。分别用水溶解并稀释氟乙酸钠标准物质,配制1.00 g/L 的氟乙酸标准储备液和100 mg/L 的13C2-氟乙酸标准储备液;临用时再用水稀释成适合浓度的标准使用液。血浆样品购自温州市中心血站,尿液样品由身体健康的志愿者提供。

1.2 样品前处理

吸取血浆试样1.00 mL,置于5 mL Eppendroff管中,加入100 μL 1.0 mg/L13C2-氟乙酸同位素内标使用液,加入2.0 mL 3%(v/v)高氯酸水溶液,旋涡10 s,超声提取5 min,于6 ℃以 10 000 r/min 离心5 min,取上清液(pH 0.5～1.0)置于15 mL具塞离心管中。

吸取尿液试样1.00 mL,置于15 mL具塞离心管中,加入100 μL 1.0 mg/L 的同位素内标使用液,加入2.0 mL 3%(v/v)高氯酸水溶液,旋涡混合10 s。

向血浆提取液或尿液提取液中加入4.0 mL叔丁基甲醚,置于多管旋涡混合器中,以最大速度旋涡3 min,以 10 000 r/min 离心3 min,移取上清液,下层水相用4.0 mL叔丁基甲醚重复萃取1次,合并2次萃取液,加入100 μL 1%(v/v)氨水丙酮溶液,混匀,于45 ℃氮气吹至近干,加入1.0 mL 0.1%(v/v)氨水溶液,旋涡溶解,过0.22 μm滤膜,待测。

1.3 分析条件

1.3.1色谱条件

分析柱为Ionpac AS 19型色谱柱(250 mm×2 mm, 7.5 μm);保护柱为AG19(50 mm×2 mm); ASRS 500阴离子抑制器(2 mm,外接水模式);氢氧化钾淋洗液由RFC-30在线自动产生;梯度淋洗:0～7.0 min, 5 mmol/L KOH; 7.0～8.0 min, 5 mmol/L KOH～70 mmol/L KOH; 8.0～14.0 min, 70 mmol/L KOH; 14.0～14.1 min, 70 mmol/L KOH～5 mmol/L KOH ;14.1～20.0 min, 5 mmol/L KOH;淋洗液流速为0.30 mL/min;柱温为30 ℃;进样体积为10 μL。

1.3.2质谱条件

离子源为电喷雾电离源,负离子模式;扫描模式为多反应监测(MRM)模式;离子源温度(TEM)为650 ℃;离子化电压(IS)为-4 500 V;气帘气(CUR)压力为277 kPa;喷雾气(GS1)压力为345 kPa;辅助加热气(GS2)压力为345 kPa;碰撞气(CAD)强度为中等(medium)。氟乙酸定量离子对为m/z77.0>57.0,去簇电压(DP)为-40 V,碰撞能量(CE)为-15 eV;13C2-氟乙酸的定量离子对为m/z79.0>59.0;去簇电压(DP)为-40 V,碰撞能量(CE)为-15 eV。质谱峰驻留时间均为 1 000 ms。

运行开始时,色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液,5.50 min时切换至离子源,8.00 min时六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

氟乙酸在水中易形成带负电荷的氟乙酸根离子,故采用电喷雾电离、负离子模式下对质谱条件进行优化,第1级四极杆(Q1)扫描时出现[M-H]-峰,以[M-H]-作为母离子进行碰撞解离,子离子扫描发现有[M-H-HF]-(m/z57.0)和[M-H-COO]-(m/z33.0)碎片离子,再对去簇电压、碰撞能量等参数进行优化,使子离子的信号达到最高,优化后的结果显示:m/z为57.0的碎片离子信号高,而m/z为33.0的碎片离子信号较低,约为m/z57.0的1/10,且基线信号较高,实际样品检测时有干扰峰存在。因此实验仅选择m/z77.0和m/z57.0作为定量离子对。设定合适的峰驻留时间(dwell time)使色谱峰的采样点数在15～20之间,可获得较好的定量重复性。优化后的质谱条件见1.3.2节。

2.2 离子色谱条件优化

氟乙酸为弱酸性水溶性化合物,特别适合用离子色谱进行分离[14,15],试验采用高容量AS 19阴离子交换色谱柱、5 mmol/L KOH对样品中的氟乙酸进行分离,然后再用70 mmol/L KOH进行强洗脱以去除色谱柱上强保留成分,可以消除对后续样品分析造成的不良影响。色谱柱流出液经阴离子抑制器抑制去除流动相中的钾离子,然后进入质谱系统进行检测。采用0.5 mL带滤头的自动进样瓶,进样前先用1.0 mL的水清洗进样管路,去除进样残留液,进样 1 000 μg/L 氟乙酸标准溶液后再进一针空白溶液,结果显示无氟乙酸残留。优化后的离子色谱条件见1.3.1节。

2.3 样品前处理方法优化

2.3.1提取剂的选择

氟乙酸为水溶性弱酸,酸度常数pKa为2.73[29],在pH<2的酸性条件下可被乙酸乙酯萃取[5,6]。考虑到血浆样品含有蛋白质等杂质,选择3%(v/v)高氯酸水溶液作为提取剂,既能提取氟乙酸又能沉淀去除蛋白质。结果表明,1.00 mL血浆样品用2.0 mL 3% (v/v)高氯酸水溶液可完全沉淀去除蛋白质,超声提取后再低温高速离心,可得到澄清的提取液,此时提取液的pH值为0.5～1.0,氟乙酸呈分子状态,易被有机溶剂萃取,在有机萃取液中加入100 μL 1% (v/v)氨水丙酮,使氟乙酸生成氟乙酸铵盐,以免氮吹过程损失,最终残渣用0.1%(v/v)氨水溶解。试验吸取1.00 mL血浆样品,添加10 ng氟乙酸,按1.2节描述处理,测定氟乙酸的色谱峰面积,并与1.00 mL血浆样品按1.2节描述处理再添加10 ng氟乙酸的峰面积进行比较,结果表明,高氯酸的提取率约为88% 。

2.3.2萃取剂

文献[5,6]报道多采用乙酸乙酯作为氟乙酸的萃取剂,考虑到叔丁基甲醚与乙酸乙酯有相似的萃取性能,故将二者进行比较。试验分别吸取1.00 mL血浆和尿液样品,添加10 ng氟乙酸,分别用4.0 mL叔丁基甲醚和乙酸乙酯进行萃取和测定。结果显示,叔丁基甲醚萃取的氟乙酸色谱峰面积比乙酸乙酯萃取液的峰面积约高20% ,因此确定叔丁基甲醚为萃取剂。

2.3.3提取液pH的选择

将7份尿液样品分别用高氯酸或氨水调节至pH 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0,再分别加入20 ng氟乙酸,用4.0 mL叔丁基甲醚进行萃取和测定。结果显示,在pH 0.5～1.0范围内氟乙酸的响应值最高,因此将此pH范围作为叔丁基甲醚的萃取条件。

图 2 加标尿液样品中氟乙酸的色谱图Fig. 2 Chromatograms of monofluoroacetic acid spiked in plasma samples

2.3.4萃取次数的选择

分别向pH 0.5～1.0血浆和尿液的高氯酸提取液添加10 ng氟乙酸,用4.0 mL叔丁基甲醚萃取3次,计算每次的萃取率,血浆和尿液样品的第1次萃取率约为62% ～64% ,第2次的萃取率约为28%～30%,前2次的萃取率总和约为90% ～94% 。因此最终采用4.0 mL叔丁基甲醚萃取2次。

2.4 基质效应

取空白血浆和尿液样品,按1.2节描述操作,得到空白样品处理液,加入氟乙酸标准溶液(10 μg/L)制作基质标准溶液,基质效应(matrix effect, ME)通过基质标准溶液和溶剂标准溶液中氟乙酸色谱峰面积的比值×100%进行评估,当ME>100%为基质增强效应,ME<100%为基质抑制效应[30]。结果显示,血浆和尿液中氟乙酸的基质效应约为61%和30% 。本法采用稳定同位素内标法进行定量,可有效校正样品中的基质效应,从而得到准确结果。

2.5 线性范围、检出限和定量限

将氟乙酸标准溶液稀释成质量浓度为0.1、0.3、1.0、5.0、50.0、500和 1 000 μg/L 的系列标准溶液(各含有100 μg/L13C2-氟乙酸同位素标准溶液),按1.2节描述进行处理,采用MultiQuant定量软件进行数据处理,以氟乙酸定量离子对与内标物的峰面积比值(Y)对相应的质量浓度(x, μg/L)进行线性回归(权重取1/x),回归方程为Y=0.016 1x+0.002 5,相关系数>0.999,线性关系良好。

在空白血浆和尿液样品中分别加入低浓度的氟乙酸进行测定,以分子离子对的信噪比≥3和10时的样品浓度作为检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果表明,血浆和尿液的检出限分别为0.03 μg/L 和0.1 μg/L,定量限为0.1 μg/L 和0.3 μg/L。方法灵敏度优于文献[16,19]报道值。在定量限水平下加标尿液样品的色谱图见图2。

2.6 加标回收率

在空白血浆中分别添加0.1、0.5、50、800 μg/L 4个水平的氟乙酸,空白尿液中分别添加0.3、5.0、50、800 μg/L 4个水平的氟乙酸,按1.2节描述进行样品处理,每个添加水平平行测定6次。结果表明,血浆和尿液样品中氟乙酸的加标回收率为96.2% ～120% ,相对标准偏差为1.1% ～13.1%(见表1),符合痕量分析的要求。

3 结论

本法采用高氯酸提取、叔丁基甲醚液液萃取净化,离子色谱-三重四极杆质谱法直接快速测定血浆和尿液中的氟乙酸,稳定同位素稀释法定量。该法准确、精密,操作简单,线性范围宽,灵敏度高,适用于血浆和尿液样品中痕量氟乙酸的测定。