23个产地瓦松槲皮素、山柰素与醇溶性浸出物含量测定

李梦璐 陈芝华 吕伟旗 汤晟凌

作者单位：1浙江中医药大学药学院（杭州 311400）；2浙江省丽水市人民医院药剂科（丽水 323000）

瓦松是景天科植物瓦松Orostachys fimbriata（Turcz.）Berg.的干燥地上部分，别名瓦花、向天草、天王铁塔草等，分布于湖北、安徽、浙江、河北、河南、江苏、甘肃、陕西、青海等省，性酸、苦、凉，归肝、肺、脾经，具有凉血止血，解毒，敛疮的功效，用于血痢、便血、痔血、疮口久不愈合等[1-2]。化学与药理学研究表明，瓦松富含黄酮类、苯甲酸类、糖苷类等化合物[3-4]，其中槲皮素与山柰素为主要活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、提高免疫力等作用[5-7]。我国瓦松分布区南北跨度大，不同地区经纬度、海拔存在差异，导致瓦松药材质量参差不齐。槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物为2015版《中国药典》规定的瓦松主要药效成分指标。因此，笔者收集我国9省23个产地瓦松种质资源，采用热浸法与HPLC法检测瓦松中主要药效成分含有量，并分析经纬度、海拔与药效成分含量间的相关性，以期为瓦松药材质量控制与良种选育提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器 Agilent 1200系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；YHG-9055A台式电热恒温鼓风干燥器（上海姚氏仪器设备厂）；FA1204B型电子分析天平（上海平轩科学仪器有限公司）；JK-WB-2A数显恒温水浴锅（上海精学科学仪器有限公司）；FW135型中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；RE-2000E旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药 材 槲皮素（批号B20527）、山柰素（批号B21132）购自上海源叶生物科技有限公司。色谱甲醇购自北京京科瑞达科技有限公司；分析级甲醇、乙醇、盐酸、乙酸、乙酸铵等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。2017年9-11月，采集浙江、安徽、陕西、江苏等9省23个产地瓦松种质资源，由汤晟凌副主任药师鉴定为景天科植物瓦松Orostachys fimbriata，详细种源信息见表1。

表1 瓦松种源信息

2 实验方法

2.1 醇溶性浸出物含量测定 精密称取样品粉末1g，加入 95%乙醇 40mL，室温静置 1h，80℃水浴（保持微沸）回流提取80min，趁热过滤，定容置50mL容量瓶，精密吸取25mL，置干燥至恒重的蒸发皿（重量a）中，80℃水浴蒸干后，于105℃烘箱干燥3.5h，迅速移至干燥器中冷却，精密称定重量（b），计算瓦松样品中醇溶性浸出物含量为[（b-a）×2]×100%。

2.2 槲皮素与山柰素含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性 Thermo ODS色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇—0.2%乙酸铵（55:45），等度洗脱；流速1.0mL/min；检测波长360nm；柱温 25℃；进样量 25μL。

2.2.2 线性关系考察 精密称取槲皮素与山柰素对照品，加甲醇配置稀释成含槲皮素1.96、3.92、7.84、11.76、15.68mg/L，山柰素 5.02、10.04、20.08、30.12、40.16mg/L的混合标准品溶液，按“1.3.1”色谱条件下注入高效液相色谱仪，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线。本试验槲皮素线性方程为 Y1=77.383X1＋4.183，R2=0.9996，山柰素线性方程为Y2=73.461X2+31.348，R2=0.9998，表明样品槲皮素与山奈酚分别在1.96～15.68mg/L与5.02～40.16mg/L的范围内线性关系良好。

2.2.3 样品含量测定 精密称取样品粉末1g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇—25%盐酸溶液（V:V=4:1）混合溶液 50mL，密闭，称重，80℃水浴回流提取60min，干燥器中冷却至室温，甲醇补足差重，摇匀，过滤，取适量滤液，过0.45μm微孔滤膜，按“1.3.1”色谱条件下测定槲皮素与山柰素峰面积，按“1.3.2”线性方程计算含量，试验重复3次。

2.2.4 精密度试验 取槲皮素与山柰素混合对照品溶液适量，按“1.3.1”色谱条件下连续进样6次，得槲皮素含量RSD值为0.98%，山柰素含量RSD值为0.43%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 随机取S9样品6份，按“1.3.3”项下方法测定槲皮素与山柰素含量，得S9样品平均槲皮素含量为0.241mg/g，RSD值为1.06%，平均山柰素含量为0.663mg/g，RSD值为2.11%，表明本试验方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 随机取S4样品，按“1.3.3”制备样品溶液，室温放置，按“1.3.1”色谱条件，分别于0、2、4、8、12、16、20、24h 进样测定峰面积，得槲皮素峰面积RSD值为2.53%，山柰素峰面积RSD值为1.58%，表明样品溶液在室温条件下24h内稳定。

2.2.7 加样回收率试验 随机取S5样品0.5g，分别加入槲皮素与山柰素对照品适量，按“1.3.3”测定样品中槲皮素与山柰素含量，计算加样回收率（%）=（C－A）/B×100%，A 为该样品中含有量，B 为加入标准品含量，C为实际测得量，各浓度梯度均重复3次，槲皮素与山柰素平均加样回收率与RSD值见表2。

2.3 统计学方法 应用DPS6.55、EXCEL2010、SPSS 17.0软件处理数据，采用单因素方差分析，聚类分析采用类平均法。

3 结果

3.1 瓦松药效成分含量HPLC优化 分别对槲皮素、山柰素色谱峰在190～400nm波长内进行吸收光谱扫描，结果表明槲皮素与山柰素在272nm与360nm处均有较大吸收峰，通过对两波长下HPLC色谱图分析，发现在波长360nm处槲皮素与山柰素色谱峰分离度较良好，同时参考2015版《中国药典》，选择360nm作为本试验槲皮素与山柰素含量检测波长。在已有文献[8-9]报道基础上，对瓦松地上部分槲皮素与山柰素提取工艺进行了优化，分别考察了甲醇—25%盐酸混合溶液体积比3:1、4:1、5:1，提取温度 70℃、75℃、80℃、85℃，提取时间 40min、60min、80min对槲皮素与山柰素提取含量的影响，结果表明，瓦松槲皮素与山柰素在甲醇—25%盐酸混合溶液体积比为4:1，80℃条件下回流提取60min即可提取完全。同时，考察了HPLC流动相甲醇—0.2%乙酸铵、甲醇—水、甲醇—0.1%乙酸水流动相，发现在Thermo ODS色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇—0.2%乙酸铵，体积比为55:45，等度洗脱，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量25μL的色谱条件下，洗脱效果较好，槲皮素、山柰素色谱峰理论塔板数均大于4000，分离度大于1.5，色谱图见图1。

表2 加样回收率试验

3.2 不同产地瓦松药效成分含量比较 供试23个产地瓦松样品间槲皮素、山柰素与醇溶性浸出物含量差异均存在统计学意义（P＜0.05），平均含量分别为0.215mg/g、0.555mg/g、4.68%。其中，甘肃定西样品槲皮素含量最高，为0.271mg/g，甘肃榆中山柰素含量最高，为0.769mg/g，河北蔚县醇溶性浸出物含量最高，为6.56%，见表3。供试瓦松样品药效成分均达到2015年版《中国药典》规定的槲皮素与山柰素总量不低于0.2mg/g，醇溶性浸出物不低于3.0%的标准，表明我国瓦松主要分布区药材质量较好，遗传多样性高，为瓦松优良种质资源筛选奠定了良好的基础。

图1 瓦松HPLC色谱图（A:混合对照品图；B:样品图；1:槲皮素；2：山柰素）

表3 不同产地瓦松药效成分含量比较

表4 相关性分析

3.3 相关性分析 药用植物的生长发育、药效成分积累受产地环境因子影响，包括海拔、温度、湿度、经纬度等[10]。相关性分析显示，瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量与纬度、海拔呈正相关关系，与经度呈负相关关系，其中槲皮素含量与海拔正相关性最高，相关系数为0.7901，与经度负相关性最高，相关系数为0.7574，见表4。结果提示，高纬度、高海拔、低经度地区栽培瓦松有利于槲皮素、山柰素与醇溶性浸出物含量积累。

3.4 聚类分析 以槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量为主要参考指标，按照欧氏距离D2=0.87的分类水平，可将23个产地瓦松样品划分为3大类（图2）。由图中可知，类群Ⅰ共13个产地，分别为浙江临安、浙江富阳、浙江景宁、宁夏同心、河南方城、浙江缙云、陕西商洛、安徽铜陵、江苏盱眙、江苏句容、河南南召、安徽黄山与陕西铜川，该类群以浙江、江苏、安徽产地为主，产地海拔较低，槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量较低。类群Ⅱ共3个产地，分别为浙江瑞安、陕西渭南与宁夏盐池，该类群瓦松平均药效成分含量中等。类群Ⅲ共7个产地，分别为湖北恩施、甘肃定西、河北顺平、甘肃榆中、河南许昌、湖北荆门与河北蔚县，该类群以甘肃、河北、湖北产地为主，大部分采集地位于高海拔地区，样品中槲皮素、山柰素、醇溶性成分含量较高。

4 讨论

瓦松是我国传统民间用药，具有清热解毒、凉血、止血、利湿、消肿等功效，已广泛应用于临床，由于瓦松资源分布广，药效成分含有量差异大，导致瓦松市场混乱，影响瓦松药材产业健康发展。本试验收集全国主分布区瓦松种质资源23份，检测其主要药效成分含有量，同时分析了生境因子，包括海拔、经度、纬度与药效成分含量间的相关性，对瓦松药材质量控制，优良种源筛选均具有重要意义。本试验优化的瓦松槲皮素、山柰素含量HPLC检测方法，操作简单、准确、重复性高，可用于瓦松药材质量评价。

图2 瓦松聚类分析图

药用植物在长期适应环境的过程中，通过调节相关生防基因表达，进而调控防御性次生代谢产物的积累，抵抗环境微生物、害虫、极端温度、盐碱、高湿等环境因子胁迫，其生物学特性、农艺性状、药效成分等受遗传与环境双重因素影响，产地、经纬度、海拔、气候条件等环境因子是影响中药材生长与药效成分含量积累的重要因素[11-12]。本研究表明，我国主分布区瓦松药材质量较好，主要药效成分含量均满足2015年版《中国药典》规定的槲皮素与山柰素总量不低于0.2mg/g，醇溶性浸出物不低于3.0%的标准；23个产地瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量均存在显著差异（P＜0.05），陕西、甘肃、宁夏产瓦松药效成分含量较高，河南、浙江、安徽产瓦松药效成分含量相对较低；瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量与纬度、海拔呈正相关关系，与经度呈负相关关系。瓦松在我国分布地域较广，本实验未收集青海、山东、辽宁等地种质资源，下一步将重点对上述地区开展药材资源收集与质量评价工作。从瓦松槲皮素、山柰素、醇溶性浸出物含量看，低经度、高纬度、高海拔栽培有利于瓦松药效成分含量积累，筛选瓦松优良种质资源时，可优先在陕西、甘肃、宁夏等种质中选择。