自噬参与氧糖剥夺对N2a细胞的损伤

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(南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳421001)

卒中是世界上常见死亡原因之一，并且是导致成人神经功能损伤的重要原因。有近20%卒中是出血性卒中，而有80%的卒中是缺血性脑卒中[1]。研究表明卒中与痴呆[2]、老年人癫痫[3]以及老年人抑郁[4]的发生密切相关。

自噬广泛存在于真核细胞中，它是一种由一系列基因调节的细胞成分自我消化的过程。自噬的功能是将细胞内可溶性大分子物质及衰老细胞器等转运至溶酶体进行降解，实现其降解产物的再循环利用，从而参与细胞内稳态的维持[5]。

已有研究表明，自噬参与脑缺血过程中。石瑶等[6]研究发现白藜芦醇通过Sirtuins1通路促进自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤，从而表明自噬在脑缺血中的激活是起保护性作用的。然而，耿武军等[7]研究表明下调自噬能改善大鼠脑缺血再灌注损伤，提示自噬在脑缺血中可能起到损伤性作用。因此，目前自噬在脑缺血过程中的作用一直存在争议。

N2a细胞是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle经A株白鼠的自生肿瘤建立，细胞贴壁良好，多数成神经元样，具有轴突样结构，被广泛用于神经病理分子机制研究。且近年来N2a细胞的OGD模型被广泛使用作为细胞水平模拟脑缺血的临床过程[8-9]。本研究利用N2a细胞体外脑缺血模型来探讨自噬在脑缺血过程中的作用，从而为后续研究自噬对脑缺血发生发展的影响以及相关机制提供基础。

1 材料与方法

1.1材料N2a细胞由上海交通大学医学院附属仁济医院干细胞中心实验室馈赠。高糖DMEM、无糖DMEM、胎牛血清购于美国Gibco公司；RIPA Buffer、BCA protein Assay Kit及SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate为美国Thermo Fisher公司产品；兔多抗Beclin 1抗体为美国Santa Cruz公司产品；兔多抗LC3B抗体、兔抗LAMP2、鼠单抗β-actin、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG以及3-MA购于美国Sigma公司；CCK8试剂盒/Cell Counting Kit-8为日本Dojindo公司产品；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒购于中国南京建成生物工程研究所。

1.2仪器二氧化碳细胞培养箱购于美国Thermo scientific公司；多气体细胞培养箱为日本SANYO公司产品；多功能酶标仪为美国Bio Tek公司产品；ChemiDoc XRS化学发光成像系统购于美国BIO-RAD公司；倒置荧光显微镜购于日本Nikon公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品。

1.3方法

1.3.1 N2a细胞培养 N2a细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2、95%空气的恒温培养箱中培养，每隔48～72 h传代一次。

1.3.2 OGD模型的建立 N2a细胞OGD模型建立参照文献[10-11]并加以改进。选用生长良好的N2a细胞,置换成无糖无血清培养基后,置于37℃多气体细胞培养箱(1%O2、5%CO2和94%N2)中分别培养1 h、4 h、8 h以及12 h,然后选择最佳处理时间。

1.3.3 细胞生长曲线的测定 细胞增殖采用CCK8法来进行测定。将N2a细胞以5×103个/孔的密度种植在96孔板中，将细胞分为Control、OGD 8h及OGD 12h组，每组设置3个重复孔，经过OGD处理后，弃原培养基，然后每孔加入90 μL新鲜高糖DMEM培养基及10 μL CCK8，37 ℃孵育1 h后在酶联检测仪上测定波长450 nm处的吸光度值。

1.3.4 细胞免疫荧光检测 取生长良好的N2a细胞种植于6 cm细胞培养皿中，待细胞生长融合到70%～80%左右，将N2a细胞分为Control、OGD 8 h及OGD 12 h组，经过OGD处理后，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛注射液固定10 min后PBS再次清洗3次。然后利用0.5% Triton-X 100对细胞进行透化处理5分钟且用PBS清洗后，置入含5%BSA液体中室温封闭30 min,加入1∶200稀释的LC3抗体4 ℃孵育过夜。接下来PBS清洗3次，再加入1∶200稀释的荧光二抗室温避光孵育30 min，PBS再次清洗3次。最后加入DAPI染色10 min，PBS清洗且封片后，置于倒置荧光显微镜下观察。

1.3.5 免疫印迹 将N2a细胞种植于6孔板中，待细胞生长融合到70%～80%左右，将细胞分为Control、OGD 8h及OGD 12h组，各组经过相应处理后，使用裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，每组各取20μg蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭处理1h，然后加入1∶200稀释的Beclin 1、LAMP2，1∶500稀释的LC3和1∶1 000稀释的β-actin抗体4℃反应过夜，TBST洗膜3次，再加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，显影。将显影所得的Beclin 1、LAMP2、LC3和β-actin条带通过ImageJ软件进行灰度值分析后，计算Beclin 1、LAMP2、LC3相对蛋白表达量。本组实验重复3次。

1.3.6 LDH释放率的测定 本实验分为Control组和3-MA组，OGD组和OGD+3-MA组，将N2a细胞分别种植于2块6孔板中，将Control组及加入含5 mmol/L 3-MA细胞培养基的3-MA组置于正常培养箱中培养，将分别加入无糖培养基及含5 mmol/L 3-MA无糖培养基的OGD组及OGD+3-MA组置于二氧化碳细胞培养箱中培养8 h,然后收集上清及细胞裂解液，按南京建成检测试剂盒说明书加入如下试剂及样品：丙酮酸、标准品或样品、双蒸水、基质缓冲液、辅酶I，混匀，37 ℃温育15 min，加入2,4二硝基苯肼，混匀，37 ℃温育15 min，再加入0.4 mmol/L碳酸氢钠溶液，混匀，室温放置5 min,波长450 nm,酶标仪测定吸光度。按照所给计算公式分别计算出各组上清及细胞裂解液中LDH浓度。LDH释放率=上清LDH浓度/(上清+细胞裂解液LDH浓度)，再分别以Control组和OGD组LDH释放率为100%来计算3-MA组及OGD+3-MA组的相对LDH释放率。

1.4统计学处理采用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析。实验数据采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析及t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1免疫荧光检测LC3在OGD处理后N2a细胞中的表达免疫荧光检查结果发现OGD处理N2a细胞8 h及12 h后，LC3表达较对照组增高，且以OGD 8 h组LC3表达增高最显著(图1)。

图1 免疫荧光检测LC3在OGD处理后N2a细胞中的表达(400×)

2.2免疫印迹法检测自噬相关蛋白在OGD处理后N2a细胞中的表达免疫印迹分析结果显示,与对照组比较,OGD 8h组及OGD 12h组，LC3II/I蛋白表达量明显增加(P<0.05),Beclin 1与LAMP2蛋白表达量有增加趋势，但差异无显著性(P>0.05)，(图2，3)。

图2 免疫印迹检测LC3及Beclin 1在OGD处理后N2a细胞中的表达

图3 免疫印迹检测LAMP2在OGD处理后N2a细胞中的表达

2.3 CCK8法检测OGD处理后N2a细胞活力将CCK8法检测结果进行统计分析，结果显示OGD处理后，N2a细胞活力较对照组明显下降，且随着OGD处理时间的延长，N2a细胞活力下降更加明显(P<0.05)(图4)。

图4 CCK8法检测OGD处理后N2a细胞活力

2.4 OGD处理对N2a细胞LDH释放率的影响综合上述实验结果，发现N2a细胞经过OGD 8 h处理后，自噬相关蛋白增加更为明显，因此采用经过OGD处理8 h的N2a细胞来检测使用自噬抑制剂3-MA后N2a细胞LDH释放率的变化。在未经OGD处理的N2a细胞中，3-MA组的N2a细胞LDH释放率相比对照组无明显变化(图5A)；而在经过OGD处理的N2a细胞中，OGD+3-MA组N2a细胞的LDH释放率相比OGD组降低(P>0.05)(图5B)。

图5 OGD处理对N2a细胞LDH释放率的影响

3 讨 论

自噬是指在自噬相关基因(autophagy-related gene,Atg)的调控下,细胞吞噬自身受损的细胞器和蛋白质,从而维持细胞内环境稳定的一种溶酶体依赖的降解途径[12]。目前的研究发现，自噬参与胰腺癌[13]、神经退行性疾病[14-15]、心肌缺血再灌注损伤[16]、慢性阻塞性肺疾病[17]的发生与发展过程中。脑缺血性疾病是危害人类身体健康的重要疾病之一[18]。近年来，越来越多的研究发现在脑缺血过程中也有自噬参与。但对于自噬在脑缺血中是否激活以及自噬的作用，目前尚未有统一的结论。

为了探讨自噬在脑缺血中是否激活，本研究采用N2a细胞OGD模型来模拟体外脑缺血过程。LC3分为LC3 I和LC3 II两种蛋白形式，前者作为细胞质性的LC3，主要分布在细胞质中，而后者作为膜型LC3则定位于自噬体膜上。因此LC3通常被作为自噬标志物来检测自噬活性[19]。研究中发现，N2a细胞经过OGD处理以后，自噬标记性蛋白LC3免疫荧光表达较对照组明显增加，表明在OGD过程中，自噬活性增加。接下来，检测了自噬相关蛋白LC3及Beclin 1蛋白表达量。结果发现OGD 8h及12h后，N2a细胞LC3II/I比值显著增加，而Beclin 1蛋白也有增加的趋势，但尚未达到统计学意义。这可能与实验样本重复一致性欠佳，从而导致统计学未有阳性结果。但是，上述研究结果基本上证实OGD过程中自噬蛋白表达增加。

近几年来越来越多研究者提出“自噬通量”的概念，认为仅仅自噬相关蛋白如LC3、Beclin 1的表达增加，甚至电镜下自噬体数目增加都不一定代表自噬活性增加，也有可能是因为自噬体数目增加，而溶酶体活性并没有增加，导致自噬相关蛋白聚集而没有得到有效的降解。自噬是自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，使自噬体内包裹的物质被有效降解的过程。LAMP2是一种定位于溶酶体膜上的重要溶酶体膜蛋白[20]，经常被使用作为一种溶酶体的标志物[21-22]。因此，进一步检测了LAMP2蛋白的表达，结果发现OGD 8 h及12 h后，N2a细胞中LAMP2蛋白的表达较对照组尽管没有显著增加，但仍有增加趋势。猜测可能与OGD处理时间点(OGD 8 h,OGD 12 h)有关,可以适当增加OGD处理时间点的范围，从而找出最适宜的OGD处理时间，或者增加其他溶酶体标志物如Cathepsin B来进一步验证溶酶体活性。综合上述实验结果，认为OGD后自噬活性是增加的。

本实验发现，N2a细胞经过OGD处理后细胞活性逐渐下降，且有显著意义。而前一部分实验也初步证实OGD后N2a细胞自噬活性增加，因此OGD后自噬活性的增加对N2a细胞是起损伤性作用的。3-MA是一种通过调节III型PI3K形成来阻断自噬体的形成的自噬抑制剂[23-24]。为了进一步证实本文的推测，使用3-MA抑制自噬，且通过检测乳酸脱氢酶释放率来进行细胞毒性检测。实验结果发现在未经OGD处理的Control组与3-MA组两组N2a细胞的乳酸脱氢酶释放率无差异，而在OGD处理后，使用3-MA处理的N2a细胞的乳酸脱氢酶释放率较OGD组下降。尽管差异未达到统计学意义(P>0.05),但是后续试验加大样本量及增加重复次数可能获得阳性结果。这部分结果提示3-MA可能减轻了OGD对N2a的细胞损伤。

总之，本实验结果表明OGD后N2a细胞自噬途径被激活，而自噬活性被3-MA抑制后减轻了OGD后N2a细胞的损伤。本实验目前初步证实OGD诱导的自噬对N2a细胞是起损伤作用的，至于自噬的具体作用机制以及信号途径，有待后续试验进一步探讨。