利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

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(南华大学病原生物学研究所，特殊病原体防控湖南省重点实验室，湖南省子靶标新药研究协同创新中心，湖南 衡阳 421001)

1989年由Fields等最早提出来的酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)是用来检测细胞核内的蛋白之间的相互作用。而瑞士Dual systems Biotech AG公司开发了一种新的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统(DUAL membrane starter kit)，该系统可以简便、快速、特异地用于检测膜蛋白之间的相互作用[1-3]。

生殖支原体、沙眼衣原体等泌尿生殖道感染病原体主要通过与宿主细胞膜上相应的受体蛋白相互作用而感染或侵入宿主细胞[4]。当无限传代的人永生化尿道上皮细胞系(SV40 Immortalized human urothelium cell line，SV-HUC-1)传到第20代的时候，依然可以检测到其标志性的蛋白，因此，该细胞是研究泌尿道组织细胞的理想细胞[5]。鉴于目前国内外尚未见关于泌尿生殖道感染病原体是与人尿道上皮细胞哪些受体蛋白相互作用，因而介导其黏附或侵入细胞的报道，因此，本研究拟通过合成人尿道上皮细胞的cDNA, 利用膜蛋白酵母双杂交系统构建SV-HUC-1细胞的cDNA文库，为下一步研究泌尿生殖道感染病原体的受体及其与宿主细胞的相互作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1主要材料Trizol试剂购自Initrogen公司，Oligotex mRNA Kits购自于Qiagen公司，1 kb Plus DNA Ladder和UltraPure Agarose为上海海科生物公司产品，Supscript double stand cDNA Kit购自Invitrogen公司；台式高速冷冻离心机(Centrifuge 5417R)为Eppendorf公司产品，PCR仪和MicroPulser电转化仪(1652100)为Biorad公司产品。

1.2 Trizol法提取细胞总RNA 提取细胞总RNA，步骤简述如下：收集培养好的细胞样本，加入2.0 mL Trizol，室温静置5 min；加入4 mL酚-氯仿，12 000 g，4 ℃离心10 min，再加入4 mL异丙醇，12 000 g，4 ℃离心15 min，弃上清后用5 mL 75%乙醇洗沉淀2次，并用500 μL DEPC水溶解，取1 μL用于1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析，其余-80 ℃保持备用。

1.3 mRNA的分离细胞mRNA的分离按Oligotex mRNA Kits的说明书进行，其步骤简述如下：将总RNA转移到无RNA酶的EP管中，向其中加入经70 ℃预热的OBB缓冲液，混匀后立即置于70 ℃水浴3 min，然后在20～30 ℃中放置10 min，室温离心2 min后弃上清，用400 μL的OW2 Buffer重悬沉淀，混匀后转移到1.5 mL离心柱上经14 000 g离心1 min，转移到一新的离心管后加入100 μL的DEPC水(70 ℃预热)，混匀后14 000 g离心1 min，转移离心柱(Millpore公司)至新的1.5 mL离心管中加入400 μL的OW2缓冲液，离心1 min后重复上一步骤，再用水洗脱一次，合并两次的洗脱液，加入60 μL 2 mol/L的乙酸钠和600 μL无水乙醇，混匀后于-80 ℃中放置15 min，离心15 min，用75%乙醇洗一遍，再次离心后溶于8 μL的DEPC水，取1 μL电泳检测并测其OD值。

1.4 cDNA的合成将4.5 μg分离纯化的mRNA补体积至22.5 μL，加入DEPC水3 μL和2 μL 3′ RT引物，置于PCR仪上70 ℃处理7 min后置于冰上；同时在另一个无RNA酶的EP管中加入10 μL 5×RT Buffer、5 μL水和2.5 μL 10 mmol/L的dNTPs和5 μL逆转录酶。待引物反应管降至45 ℃时孵育2 min，将其加入上述PCR反应体系中，混匀，置于50 ℃孵育1 h，即生成第一链cDNA。加入Glycogen (20 μg/μL)、NH4OAc(7.5 mol/L)和无水酒精于-80 ℃沉淀，16 000 g，4 ℃离心30 min，弃上清后加入70%酒精，离心后室温干燥并用66 μL DEPC水溶解cDNA。再通过DNA聚合酶合成cDNA相应的第二条链，然后加入160 μL酚-异戊醇-氯仿混合物，离心5 min，用乙醇沉淀上清，再用34 μL DEPC水溶解。

1.5 cDNA与载体的连接将cDNA产物与T4 DNA连接酶于16 ℃孵育24 h，以将cDNA末端连接上5′ A接头，经T4 DNA聚合酶将其补平，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大于1 kbp片段后用DEPC水溶解。将7 μL cDNA与3 μL经酶切处理线性化的pPR3-N载体混合，加入5 μL Infusion重组酶和5 μL DEPC水，混匀后于50 ℃反应1 h，加入2 μL蛋白酶K和78 μL无菌水，混匀并于-80 ℃放置1 h，加入Glycogen (20 μg/μL)、NH4OAc(7.5 mol/L)和无水酒精于-80 ℃沉淀，离心后用乙醇洗涤，最后用10 μL DEPC水重悬cDNA沉淀。

1.6电转化大肠杆菌感受态细胞将2.5 μL重组产物和50 μL感受态细胞加入-80 ℃预冷的电转杯，于电转化仪上电击后迅速加入1 mL LB培养基，将4份转化后菌液合并后补足培养基到5 mL，37 ℃震荡培养1 h，将培养物稀释101、102、103、104倍，分别取10 μL涂板。

1.7膜蛋白酵母双杂交文库的质量鉴定将10 μL转化后细菌原液稀释1 000倍后，取10 μL涂布在含氨苄抗性的LB平板上，24 h后计数，以鉴定文库的库容量。为了鉴定插入片段的大小，随机在平板上挑取24个单克隆进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经DNA测序后进行BLAST比对以分析其是否为人源性。

2 结 果

2.1成功提取SV-HUC-1细胞的总RNA 提取了SV-HUC-1细胞的总RNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示：所提取的RNA出现两条清晰的条带，无降解，18sRNA条带亮度大约为28sRNA条带的亮度的1/2，这说明提取的SV-HUC-1细胞RNA质量较好，完全满足后续构建文库的需要。

图1 SV-HUC-1细胞总RNA的琼脂糖凝胶电泳1：Total RNA；M：DNA Marker

2.2成功分离SV-HUC-1细胞的mRNA 用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析经Oligotex mRNA Kits分离纯化的mRNA，如图2所示：mRNA呈弥散灶分布，条带清晰且分布均匀，说明分离的mRNA质量合格。根据测定的OD值计算，mRNA的总量约为5.1 μg，说明成功分离到SV-HUC-1细胞的mRNA，且分离的量可以满足后续建库需要。

2.3构建的膜蛋白酵母双杂交文库具有较高的库容为了检测文库的库容，将10 μL原始电转化菌液稀释100倍后，取10 μL涂板，平板上共长出240个克隆，共有5 mL原始电转化菌液，因此，总库容量为：240/10×100×1000×5=1.2×107CFU，说明构建的文库具有较高的库容。

图2 人永生化尿道上皮细胞mRNA的分离与纯化1：mRNA；M：DNA分子质量标准

2.4构建的膜蛋白酵母双杂交文库具有高的重组率和随机性为进一步鉴定文库的重组率和随机性，对随机挑取的24个单克隆进行PCR后经琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示：24个克隆均扩增成功，其重组率达到了100%；且由图可知，插入的片段长度处于400～2 000 bp之间，其平均长度约为1.2 kbp左右，说明文库具有较好的随机性[7]。BLAST分析表明这些外源插入片段均为人源性。

图3 SV-HUC-1细胞cDNA文库随机克隆的PCR产物琼脂糖凝胶电泳1～23：PCR产物；M：DNA分子质量标准

3 讨 论

泌尿系感染通常可导致不孕不育、急慢性非淋菌性尿道炎[6]、子宫内膜炎等疾病。且有相关资料表明生殖支原体、穿透支原体等泌尿生殖道支原体与人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染密切相关[7-8]。因此，近年来，泌尿生殖道病原体感染越来越引起人们的广泛关注。

病原体感染或侵入宿主细胞依赖于病原体和宿主胞膜上相应受体蛋白的作用，因此，病原体的组织亲嗜性是由病原体的黏附蛋白和宿主细胞的受体蛋白的特异结合决定的。通过深入研究能与病原体特异结合的宿主细胞膜表面的受体，有助于了解病原体的致病机制，并可利用受体模拟分子或者拮抗分子来阻挡病原体黏附或侵入宿主细胞，从而开发出新型药物或者疫苗防治病原体感染。

免疫共沉淀技术、亲和蛋白组学技术和酵母双杂交技术等都可用于研究病原体与宿主细胞相应受体蛋白之间的相互作用。其中由Fields等在1989年提出的酵母双杂交技术是现在研究蛋白质相互作用的最有效的手段之一[4]，该方法利用诱饵和猎物蛋白相互作用的报告基因，判断特定蛋白之间有无相互作用[9]。由于是在细胞核内融合蛋白通过相互作用而激活转录，因此经典的酵母双杂交系统并不可以用于膜蛋白之间的研究，而瑞士Dual systems Biotech AG公司开发的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统(DUAL membrane starter kit)无需核定位信号、且泛素蛋白对具有相互作用的蛋白的影响很小，可检测膜蛋白与其它蛋白之间的相互作用[10-12]。因此，基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术目前已广泛用于寻找病原菌与宿主细胞受体蛋白的相互作用。如Grefen C等利用该方法证实肺炎衣原体CPj0783蛋白能够识别人Huntingtin-protein14蛋白[13]痢疾杆菌的IpaC蛋白可以与人胶原酶蛋白发生相互作用，提示胶原蛋白酶可能是痢疾杆菌的受体作用靶点[14]。

为了阐明泌尿生殖道感染病原体与宿主细胞受体蛋白相互作用的关系及其可能的致病机制，本研究利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统构建了SV-HUC-1的cDNA文库。在研究中，我们使用同源重组的方式将合成的cDNA与经酶切处理线性化的pPR3-N载体进行连接，由于线性化的DNA两端与基因组DNA的多处序列具有同源性，因而后续的重组连接更准确，该重组方法整合了其它公司所用连接方法的优点步骤相对简单，克服了其连接效率低的缺点，从而大大提高了文库质量[15]，且方便今后将该文库样本构建到任何其它载体上。本研究中构建的cDNA文库的库容达到了1.2×107，一般而言，如果文库的平均滴度在5×106～1×107之间，则表明文库的质量较好，且本研究中构建的文库具有很高的重组率和随机性，因此，本研究成功构建了基于分离泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统的SV-HUC-1 cDNA文库，为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主细胞的相互作用，阐明泌尿生殖道感染病原体感染宿主细胞的致病机制奠定了实验基础。我们在下一步的研究将利用此文库筛选生殖支原体、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌等常见泌尿生殖道感染病原体的受体蛋白，以明确这些病原体与宿主受体蛋白的相互作用、阐明其可能的致病机制。